Способ получения ростового протеина

СОЮЗ СООЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Я БРЕТ ТЕЛЬСТВУ Н АВТО М х 54) (57) СПОСОБПРОТЕИНА, путем отки сыворотки ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ(71) Государственный научно-исследовательский институт стандартизациии контроля медицинских биологическипрепаратов им. Л.А.Тарасевича(56) Туе 11 ег а 1. Нер 1 асевеп ойАа 1 ва 1 Бегцв Ргоге 1 пз Ьу Нцвап а 1 Ьцв 1 п Гог дгоыгЬ апд 1 пгегГегопРгодцсг 1 оп Ьу Мава 1 ча Се 11 з.Ппдсей Бгагез Рагепг, Арг. 15, 19804, 198, р. 479,М 1 сп 1 1 Нехасоча О. Сц 11 чаг.1 аог Мавва 1 ь.ап Се 11 з 1 п а Мед 1 цв м 1 гпегоюгЬ-рговогпя ргоге 1 п Ггов са 1 Евегап. - Асга чдго 1 о 8 у, 1966, В 10,р. 254-259,ОЛУЧЕНИЯ РОСТОВОГОногократной обрарови животных осал,ЯО 1250 Юв 4 С 12 Н 5/00/ А бТ дающим реагентом, экспозиции смесии ее центрифугировання после каздойобработки с паследуюгим отделениемосадка, очисткой и стерилизациейцелевого продукта, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повьппения чистотыцелевого продукта, обработке подвергают сыворотку крови крупного рогатого скота, в качестве осалдающегоагента используют 30-404-ный водныйраствор полиэтиленгликоля с мол.м.3000 - 6000 дальтон, обработку осуществляют двукратно, при этом припервой обработке раствор полиэтиленгликоля добавляют к сыворотке доконечной концентрации 8-107, а привторой - до 14-163, экспозицию смеси проводят в течение 10-20 мин,при этом после первой обработкии центрифугирования рН супернатантадоводят до 5,3-5,6 уксусной кислотой,.а перед очисткой осадок растворяют в забуференном растворе хлористого натрия с рН 8,0-9,0.Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при работе с клеточными культурами и и вирусологии.Целью изобретения является упрощение способа и плвьппецие чистоты целевого продукта за счет улучшения осаждения целевого продукта.П р и м е р 1, К 80 мл сыворотки крупного рогатого скота добавляют 20 мл 407-ного водного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000-4000 дальтон, Смесь интен" сивно встряхивают. Полученную суспенэию после экспозиции в течение 10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при 2000-3000 об/мин 10 мин,Надосадок сливают в 100-граммовый флакон, добавляют при встряхивании 153-ный водный раствор уксус. ной кислоты из расчета 1,0-1,2 мл кислоты на 80 мл надосадка с последующим добавлением 20 мл 407.-ного раствора полиэтиленгликоля. Полученную взвесь тщательно встряхинают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют 10 мин при 2000-30000 об/мин, Надосадок удаляют, осадок однократно промывают заранее приготовленным забуференным физиологическим раствором рН 8,0-9,0 и растворяют в 100 мл этого же растворителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны типа ИМфирмы Амикон до концентрации общего белка в препарате 4-67 Затем препарат стерилизуют путем- фильтрации и используют н работе,П р и м е р 2. К 80 мл сыворотки крупного рогатого скота добавляют 20 мл 357.-ного водного раствора полиэтиленгликоля с ММ 3000-6000 дальтон. Смесь интенсивно встряхивают, Полученную суспензию после экспозиции в течение 10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 1 О мин. Надосй 1 ок сливают в 100-граммоный флакон, добавляют при встряхивании 153-ный водный растнор уксусной кислоты иэ расчета 1,0-1,2 мл кислоты на 80 мл надосадка с последующим добавлением 353-ного раствора полиэтиленгликоля с ММ 5000-6000 дальтон до конечной концентрации 14- 16%. Полученную взвесь тщательноВНИИПИ Заказ 4376/20Произв.-полигр. пр-тие, встряхивают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при 2000- 3000 об/мин, Надосадок удаляют, оса док однократно промынают забуференным физиологическим раствором рН8,0-9,0 и растворяют н 100 мл этогоже растворителя. Полученный растворподвергают ультрафильтрации черезмембраны типа ИМдо концентрацииобщего белка в препарате 4-67,Затемпрепарат стерилиэуют путем Фильтрации 1 О 15 20 25 Споооб осуществляют вф течение 1 сут, тогда как известный способ занимает около 7 сут, позволяет получить более чистый препарат (содержание 7 -глобулиновой фракции менее 0,5 ., н прототипе - 5-8 Е),Ростовой протеин используют следующим образом.Культивирование линии клеток Л с применением ростового протеина.Проведено 5 пассажей с посевной дозой 100000 кл/мл и 2 пассажа с посевной дозой 40000 кл/мл. При посевной дозе 100000 кл/мл н каждом пассаже клетки Формируют монослой на 3-4 сут. Индекс пролиферации (ИП) после 5-го пассажа составляет 8,7. При посевной дозе 40000 клеток в мл монослой формируется на 5-6 сут ИП,2, При обеих использованных посевных дозах клетки в пассаже сохраняют типичную морфологию без признаков дегенерации. Культивирование линии диплондных клеток М, с применением ростового протеина,Проведено 4 пассажа с посевной дозой 200000 кл/мп. В каждом пас 30 35 40 саже клетки формируют монослой на 3-4 сут с характерной морфологией без признаков дегенерации. ИП после 4 пассажа - 2,05. 45 На первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов в возрасте 9-10 дней испытания ростового протеина на ростстимулирующую активность проводились с концентрациями препарата, 7: 10, 1, 0,5, 0,25, 0,12 при посевной дозе 300000 кл/мл. Монослой формируется на 2-3 сут. Препарат обладает рост 50 стимулирующей активностью в концент 55 рациях 0,25 - 1. Тираж 490 Подписное Ужгород, ул. Проектная, 4,и используют при культивировании клеток человека и животных.