Способ определения фосфогидролаз в тканях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 65920 А О НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г, э МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТО й буфер с рН 7,4 ни и компонентов,раствора 0,1 М фосфатныпри следуюшем соотношемас. %:п-Формальдегид0,1 М фосфатныйбуфер с р Н 7,4а инкубацию проводят в тепри 36 - 37 С в среде, допжашей сахарозу. а в караствора - трис-малеатньпри следующем соотношемМ:Исследуемый субстратСоль магнияСахарозаСоль свинцатрис-Малеатныйбуфер с рН 7,2и по выпадению осадка опфосфогидролаз.- 4,0 Осчение 25 -лнительнчестве буй буфернни комп альное 30 мин содерерного рН 7,2 нентов,2,2 2,2 0,2 2,2 5 -- 90 налич редел яю ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательскийцентр по охране здоровья матери и ребенка(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОГИДРОЛАЗ В ТКАНЯХ, включаюшийих фиксацию в буферном растворе п-формальдегида, промывку в растворе сахарозыи инкубацию в среде, содержащей исследуемый субстрат, буферный раствор, солимагния и свинца, отличающийся тем, что,с целью повышения точности определенияфиксацию проводят в течение 1,5 - 2 ч в составе, содержащем в качестве буферного 511 б 01 М 1/28, А 61 В 1011Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии и цитохимии ферментов, и может быть использовано в практической медицине и биологии.Цель изобретения - повышение точности определения.Способ осуществляют следующим образом.Исследуемую ткань фиксируют в течение 1,5 - 2 ч в составе: 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4, содержаший.пформальдегид 2,0 - 4,0 мас, В, Затем. промывают в растворе сахарозы и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40 - 50 мкм. Полученные срезы инкубируют в течение 25 - 30 мин при 36 - 37 С в среде состава, мМ: субстрат 2 - 2,2, трис-малеатный буфер с рН 7,2 80 - 90, соль магния 2 - 2,2, сахароза 0,25 - 0,28, соль свинца 2 - 2,2. По выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз.Пример 1. Проводят ультрацитохимическое определение фосфогидролаз (АТФазы и 5-нуклеотидазы) в клетках печени белых крыс.Кусочки печени крысы толщиной 2 - 3 мм фиксируют 2 ч в фиксирующей смеси следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 3 мас.пформальдегида при 4 С, промывают в трех сменах 0.25 М сахарозы при 4 С соответственно 1 О, 20 в 30 мин и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40 - 50 мкм. Полученные срезы затем инкубируют 30 мин при 37 С в инкубационной среде состава, мМ: субстрат 2,1; трис-малеатный буфер с рН 7,2 85; соль магния 2,1; сахароза 0,26; соль свинца 2,1. В качестве субстрата используют АТФ, 5-АМФ и р-глицерофосфат натрия. Активность АТФазы и 5-нуклеотидазы определяют на плазматической мембране в эндоплазматическом ретикулуме и комплекте Гольджи, в ядерной оболочке, хром атине и ядерных рибонуклеопротеидах - в ядрышках, интерхроматиновых и перихроматиновых гранулах, перихроматиновых фибрилах и клубочковидных65920 5 10 15 20 25 30 35 2тельцах. Отрицательная реакция с р-глицерофосфатом натрия свидетельствует о специфичности гистохимической реакции на АТФазу и 5-нуклеотидазу.Пример 2. Кусочки, печени крысы толщиной 2 - 3 мм фиксируют 2 ч в 1,5 Я-ном растворе глутаральдегида на 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,2) при 4 С, промывают в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) с добавлением 7,5"/о-ной сахарозы и затем инкубируют 30 мин при 37 С в следующей среде, мМ: АТФ или 5-АМФ 0,83; трисНС 1. - буфер (рН 7,2) 80; сульфат магния 10; нитрат свинца 3,6. Далее образец подвергают обработке и электронномикроскопическому исследованию по общедоступной методике.Активность АТФазы и 5-нуклеотидазы определяют практически только на плазматической мембране. В редких клетках слабую активность можно наблюдать в ядрышках клеток. Кроме того, по всем клеткам наблюдается слабый, равномерно распределенный диффузный осадок за счет высокого уровня неферментативного гидролиза субстрата до 370 согласно биохимическим определениям в среде данного состава.Изобретение позволяет повысить точность определения (доля неферментативного гидролиза, определенная биохимически, составляет по известному способу 37 о, по предлагаемому - 4,4 о" ), устойчивость (стабильность) инкубационной среды за счет введения в среду с буферной смесью хелатирующего агента (малеата) и установления эквимолярного соотношения концентраций (по 2 мМ) ионов свинца, ионов магния или субстрата, упростить процесс, сделав возможным его использование для определения различных фосфогидролаз (АТФаза, 5-нуклеотидаза, Г-ф-аза, неспецифическая фосфатаза) и проведения серийных экспериментов, а также одновременного создания дополнительных контрольных проб для каждой из фосфогидролаз, исследуемых в данной серии опытов.Редактор О. ГоловачЗа каз 4300/34 Составитель В. ЧистяковТехред И. Верес Корректор А. ТяскоТираж 897 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и оз крытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/8филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4