Способ получения ингибитора полимеризации фибрина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1(5 П А 61 В 10/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ 4 ь Ю 3 4 й ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЮ Й АВТОРСЙОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Тюменский государственный медицинский институт(56) 1. Белицер В.А., Варецкая В.А. Цинкаловская С.Н., Позднякова Т.М., Орловская Н.М. Изучение некаторых особенностей высокомолекулярных продуктов триптического гидролиза фибриногена = ф Укр.биохим.а., 1970 ю т 42 Се 165 1732, Белицер В.А;, Варецкая Т.В Циикаловская С.Н., Позднякова Т.М., Толстых В.М. Выделение и исследование высокомолекулярного триптического фрагмента фибриногена.Укр. биохим. а. 1972, т44 с. 411-417 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРАПОЛИМЕРИЗАЦИИ ФИБРИНА путем диалнзасырьевого продукта с последующейхроматографической очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения способа, в качестве сырьевого. продуктаиспользуют сыворотку крови, полученный диалиэат концентрируют выпариванием, а очистку диализата.проводятхроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А25 в градиенте .0,05-0,15. М аммонийноацетатного буфера с рй 7,4-7,6.Заказ 7398/3 Тираж 713 . ВНИИПИ Государственного комитеТа СССР по делам изобретений и открытий. 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 ЪПодп ис ное филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Изобретение относится к областимедицины, а именно биохимии.Известен способ получения ингибитора полимеризации фибрина путем получения фибриногена иэ бычьей плавнывысаливанием сульфатом натрия, расщеплением его трипсином, гель- фильтрации на колонке с сефадексом 9-150,выявлением фракций с ингибиторнойактивностью и лиофилизацией(1.Однако известный способ не поэво- (Оляет получить целевой продукт с высокой чистотой,Наиболее близкимк предлагаемомуявляется способ получения ингибитора полимериэации Фибрина путем диалиэа сырьевого продукта с последующей хроматографической очисткой 12 3.Однако известный способ длите-,лен, так как на подготовительныеоперации и .освобождение от солейзатрачивается более 5 сут.Цель изобретения - ускорение спо-соба.Поставленная цель достигается тем,что при осуществлении способа получения ингибитора полимеризации фибрина путем диалиэа сырьевого продукта с последующей хроматографическойочисткой целевого продукта,в каЧестве сырьевого продукта используютсиворотку крови, полученный диали- З 0зат концентрируют выпариванием, аочистку диалиэата проводят хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А 25 вградиенте 0,05-0,15 М амконийноацетатного буфера с рН 7,4-7,6, 35П р и м е р, 1 л стабилизированной цитратомнатрия (.3, 8; 91)плазви крови нагревают на водянойбане (56 С) в течение 15 .мин, затемосвобождаются от выпавшего фибрина центрифугированием (1250 д,15 мин)Освобожденную от фибриногена жидкость (сыворотку) диализуют черезцеллофан против дистиллированной воды (1:2), сменяя воду через каждые4 ч (всего пять. Раз). Порции диализата объединяют,Объединенные порции диалиэата(примерно 10 л) Упаривают на кипящей водяной бане до объема 50 мл.В сконцентрированный диализатвносят 180-200 мп геля ДЭАЭ-сефадекса А 25, предварительно набухшего, в 0,05 М аммонийноацетатном буфере с РН 7,"4-7,6, и перемешивают при комнатной температуре в течение0,5 ч,Вышеуказанной смесью заполняютстеклянную колонку (15 х 500 мм), позволяя жидкости свободно стекать чеРез нижнее отверстие колонки - формируется столбик геля.Через колонку пропускают 300 мл0,05 М амменийно-ацетатного буФера с РН 7,4-7,6, затем 300 мл 0,10 М. аммонийно-ацетатного буфера с темиае значениями РН и 800 мл 0,15 Маммонийно-ацетатного буфера с темиже значениями РН. Скорость протока60-70 мп/ч.При проьввании колонки третьимбуферным раствором элюат собираютпорциями по 10 мл и в каждой из нихопределяют наличие ингибитора полимеризации известным методом.Порции элюата, содержащие ингибитор полимеризации, объединяют иудаляют летучий буфер выпариваниемна выпарительных чашках (кипящаяводяная баня) до полного удаленияраствора.Сухой остаток на чашках раство-.ряют в 10 мл дистилированной водыи центрифугированием (8000 д,15 мин)освобождаются от нерастворившихсячастиц, Надосадочная жидкость содержит ингибитор полимеризации фибрина (целевой продукт).При многократном применении способа выход ингибитора составляет28000 усл.ед.,из 1 л плазмы, что составляет примерно 100 от его содержания в исходном материале. Полу-,чаеьаюй предлагаемымспособом ингибитор полимеризации по данным хроматографии на бумаге в системе бутанол - ледяная уксусная кислота -вода 4:151 двукратное пропускание)и 4."1:Г (двукратное пропускание)содержит в качестве примеси следовыеколичества серина и аспарагиновойкислоты.Известный способ позволяет получать гетерогенный по данным электроФореэа ингибитор, содержащий значительную примесь фосфатов и хлориданатрия.Предложенный способ позволяет сократить число операций и.времени,необходимого ддя полуЧения ингибнтора полимеризации Фибрина в четырераза (80,5 ч предлоаенный, 350 ч известный).