Способ получения биомассы

СОКИ СОВЕТСНИХИИИаюиснипРЕСПУБЛИК 3 ШС 12 И 1 10 С 2 И 1 32 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН ПАТЕНТУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) Есихару Миура, Мицуо Оказаки, Сецуо Комемуси, Тендэи Саката, Сатоси Сироза, Сатоси Обана (Япония) (71) Секисуи Кагаку Коги К.К. иЕсихару Миура (Япония)(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫпутем культивирования продуктов еебактерий на питательной среде, содержащей метанол в качестве основного ЛО 1 О 15831 А источника углерода, источник азотаи минеральные соли, в условиях аэрации среды с последующим отделениембиомассы и ее сушкой, о т л и ч аю щ и й с я .тем, что, с целью повышения выхода биомассы, в качествебактерий, продуцирующих биомассу,используют штамм Р 1 ачоЬасеег 1 цв Созаепз 1 з ВБ(РЕВМ-Р 9 4058) илиРзецйовопаз иаЕауаваепз 1 з ПБМальтоэа 50 Сахароза Лактоза Трегало родуц овани ислот)ахма сла амм лен из почвы. ный рост при 30 фС в течение 5 дн.,с образованием осадка, желатин раз.жижает,На лакмусовом молокепри 37 Скультура коагулирует (свертывается)Биохимические признакиНитраты не восстанавливает,Реакция денитрификации - отрицательная.Ретикулярная реакция (МЙ-тест)отрицательная. 1 ОЧР-тест - положительная реакция.Не продуцирует индол, сероводородКрахмал гидролиэует,Не утилизирует цитраты (средаКоэера) 15Утилиэирует неорганический азот,аммонийные соли.Азотнокислые соли (нитраты) неутилизирует.Пигмент не продуцирУет (среды А 2 Ои В Кинга).Уреазная реакция - положительная.Оксидазная реакция - положительная.25Каталаэная реакция - положительТемпературу и рН для роста бактерий на метанолсодержашем бульоневарьируют (рН регулируют путем добавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты). Рост ЗОхороший при рН от 5 до 9. При рН 4и 10 роста не происходит. Роот хороший при температуре в диапазонеот 5 до 45 С предпочтительный диа"-пазон 25 - 43 С). При 50 С роста не 35наблюдается.Отношение к кислороду - аэробнаякультура,О-Р тест (по.методу Хьюго Лейфсона) - глюкоза не метаболизируется 4 Они в аэробных, ни в анаэробных условиях (не отмечается никаких признаков образования кислоты и газа).Продуцирование кислоты и газа иэсахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара 451 вес.В при 37 ОС в течение;10 дн,)показаны в табл. 9. Ассимиляция сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации 0,5 вес. % при 37 С в течение 10 дн.) представлена в табл 10.Таблица 10Метанолсодержащая агаровая среда использовавшаяся в опытах (тестах ) по культивации, имела следующий сос тав, мг:КНРО 4 1500ХаНРО 4 3200(ИН 4) ЯО 4 3000ИдБО 4 7 НО 500СаС 1 а 2 Нй 0 100РеЯО 4 7 НО 10пО 4 7 Н О . 1,4СцБОА. 5 НО 0.,25ИаМОО 4 2 Н О 0,24СоС 1, 6 Н О 0,24МпБО 4 5 Н О 1,2Агар 20000Дистиллированная вода 1 л 10 15 Культуральную среду стерилизовали при 120 С в течение 15 мин, после чего прибавили в асептических усло виях 20 г метанола.Иетанолсодержащий бульон имел аналогичный состав, но не использовали агар, а количество метанола сократили до 5 г. 25Штамм СогупеЬасГегшв уавапаз 1 епэ 1 э РБ(РЕИ 1-Р Р 4106) .Морфологические признаки:Штамм культивировали на питатель.ном бульоне и питательной агаровой среде при 37 Св течении 3 дн.форма и размер клеток - короткие палочки от 0,5-0,6 до 0,6-0,9 мкКолонии клеток единичные или парные, а,также плеоморфные или изогнутые и Ч-образные отдельные (разделенные) клетки.Подвижности нет,Споры отсутствуют.Окрашиваемость по Грйму - поло-жительная, 40Кислотоустойчивость - отрицательная.Рост бактерий на различных культуральных средах:На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн. Колонии клеток круглые диаметром 2-2,5 мм с выпуклостью или горбом, с гладкой ровной поверхностью и целыми краями, желтые, блес. тящие, полупрозрачные и маслянистые. На чашках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при 37 С в течение 5 дн., колонии клеток круглые диаметром 2-3 мм с гладкой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и маслянистые.На скошенном питательном агаре - 60 нитевидный рост при 37 фС в течение 3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные (выпуклые) с гладкой поверхностью и целыми краями, желтые, блестящие, полупрозрачные и маслянисгые. 65 На скошенном метанолсодержащемагаре - нитевидный рост при 37 С втечение 5 дн., колонии клеток умерен-,но выпяченные с гладкой поверхностьюи целыми краями, опалесцирующие,блестящие (глянцевитые), полупрозрачные и маслянистые.На питательном бульоне - росгумеренный при 37 С в течение 3 дн.,образуется осадок, культура слегкаполупрозрачная, на поверхности иеобразуется пелликул.На питательном бульоне (встряхивание в процессе культивирования)интенсивный рост при 37 С в течение3 дн., культура становится мутной,образуется осадок, полупрозрачная,На пептонном водном бульоне - интенсивный рост при 37"С в течение3 дн., культура становится мутной,образуется осадок.Культура на метанолсодержащембульоне - интенсивный рост прио37 С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок,на поверхности образуется тонкаякольцеобразная пелликула, культураполупрозрачная (просвечивающая).На метанолсодержащем бульоне(встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при37 С в течение 3 дн., культура стаоновится мутной, образуется осадок,культура полупрозрачная.На питательном бульоне (на столбиках или палочках) - рост на поверх.ности или протекающий до глубины порядка 2-3 мм при 37 С в течение3 дн., поверхность опалесцирующая,На питательном желатиновом бульоне (на столбиках желатины) - поверхностный рост при 30 С в течение5 дн. с образованием осадка, разжи,жения желатины не происходит.На лакмусовом молоке - при 37 Скультура коагулирует,Биохимические признаки:Восстанавливает нитраты.Реакция денитрификации - положительная.Ретикулярная реакция (МК-тест)положительная.ЧР-тест - положительная реакция.Не продуцирует индол, сероводород,Крахмал гидролиэует.Утилиэирует цитраты (среда Козера), аммонийные соли, азотнокислыесоли (нитраты).Не продуцирует пигмент (среды Аи В Кинга).Уреазная реакция - отрицательная.Оксидаэная реакция - отрицательная.Каталазная реакция - положительная.Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем бульоневарьируют (рН регулируют путем добав 22211015831Продолжение табл. 12 ления водного раствора соляной кислоты или гидроокиси натрия), Хороший рост наблюдается в диапазоне рН от 5 до 9, при рН 5 и 10 рост отсутствует. Хороший рост наблюдается при темпера.- туре в диапазоне от 5 до 41 С (пред почтительно в интервале 25 - 40 С). При 42 С роста не происходит.Отношение к кислороду - аэробная культура.0-Р тест (по методу Хьюга Лейф сона) - глюкоза не метаболизируется ни в аэробных, ни в анаэробных условиях (не наблюдается никаких признаков образования кислоты и газа),Продуцированиекислоты и газа нэ сахаров (при использовании пептонной воды, содержащей сахар в концент. рации 1 вес, Ъ, при .37 С в течение 10 дн.) показано в табл. 11.Таблица 11 Ассимиляция Сахар Д-ГЛюкоэаД-МаннозаД-ФруктозаД-Галактоза Мальтоэа Сахароза Лактоза ТрегалоэаД-СорбитД-МаннитИнозитГлицерин.Крахмал Сахар Продуцирование кислоты Продуцированиегаза25+ (слабая) 30 Штамм выдеЛен из почвы.Метанолсодержащая агаровая среда, использовавшаяся в опытах (тестах 1 по культивации бактерий данного штамма, имела следующий состав, мг:КН,РО 1500ЙаНР 04 3200+ (слабое) Трегалоза Д-Сорбит Д-МайнитИнозитГлицерин Культуральную среду стерилизовалн при 120 С в течение 15 мин,послечего прибавили в асептических условиях 20 г метанола.Метанолсодержащий бульон имеланалогичный состав, но не содержалагара, а количество метанола составляло 5 г.Эксперименты проводили в соответствии с "Руководством Бержи по опре делительной бактериологии" ("ВегцеуМапца 1 оХ Пег,егв 1 пай 1 че ВасСег 1 о 1 ояу") (8-е изд., 1974 г.), "Руководством по практической бактериологии"(издано Ассоциацией Выпускников Ин ститута Медицинской Науки, исправ,. Крахмал ффффЗВМФ Сахар Ассимиляция Л-Арабиноза+ (слабая) Д-Ксилоэа Ассимиляция сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации 0,5 вес.В при 37 С в течение 10 дн) приведена в табл. 12.Таблица 12,Марузен Компани Лтд.) и моиографией1 Систематика и определение микроорганизмов" (Тахопову апй Ре 1 егв 1 па 11 оп оЕ М 1 сгоогдап 1 звз) Такейи Хасегава (1975 г., Изд-во Токио Университи Пресс),Процесс культивирования вели вжидкой среде в аэробных условияхпри 5 - 45 фС (предпочтительно 25 - 1043 ОС), рН 5 - 9 (предпочтительно6 - 8) периодическим или непрерывным способом.Метанол используют в качестве основного источника углерода в куль- (5туральной среде, при этом предпочтительное количество его,составляет неболее 50 г/л.В качестве источников азота используют неорганические вещества,такие как аммонийные соли и нитраты,и органические вещества, такие какмочевина, казеин, жидкий кукурузныйэкстракт, пептон, дрожжевой и мясной экстракты. Источниками Фосфораявляются соли фосфорной кислоты(фосфаты), а в качестве полезныхисточников серы используют различные соли серной кислоты (сульфаты),В качестве источников металлов, не.обходимых для культивирования микро ЗОорганизмов, таких как магний, калий,кальций, натрий, железо, марганец,медь, цинк, молибден, кобальт и бор,в культуральную среду вводят соответствующее количество солей указанных металлов.В случае необходимости в культуральную среду добавляют также и другие вещества, требующиеся для роста микробных клеток, такие как 40 витамины или аминокислоты, а также вещества, стимулирующие рост микроорганизмов.Величину рН культуральной среды регулируют путем введения Фосфата 45 и аммиака.Выделение (извлечение):микробных клеток из культуральной среды осуществляют обычным образом, например путем фильтрации, центрифугирования 5 О и т.д. с последующей промывкой и сушкой биомассы микрооргани мов.Согласно предлагаемому способу .метанол, выпускаемый химической промышленностью, может бйть утилизйро- ван как основной источник углерода микробныМи клетками ряда штаммов, принадлежащими к Р 1 ауоЬас 1 ег 1 цв йазаепз 1 з, Рзецйовопаз юаЕауаваепзхз, Р 1 ачоЬасйег 1 цв веСЬапо 11 со 1 а, Рзецйо вопаз Ыуогоепзхз, Рзецйовопаз а 1 сЬ 1- 6 О епз 1 з, СогупеЪасгег 1 цв уавапаз 1 епз 1 э, которые можно получать в больших ко". личествах и с хорошим выходом. Пос" кольку получаемые микробные клетки содержат значительное количество 65 белковых веществ ( протеинов 1, ихможно испольэовать не только в ка"честве кормовых или пищевых веществ,но также в качестве веществ медицинского назначения и технических материалов.П р и м е р 1. Состав (рецептура ) культуральной среды, мг:КН,РО 4 1500Иа 2 НР 04. . 3200(ИЙ 4)50Мя 504. 7 Н 0 500СаС 1 2 Н,О 100РеЯО. 7 НО 20Еп 304. 7 НО 2,8СцЯО 4 5 Н 20Иа 2 Мо 04 2 НО 0,48Мп 504. 5 Н О2,4Дистиллированная вода 1 лКультуральную среду поместили всклянку емкостью 1 л и стерилизовали при 120 С 15 мин, Затем добавилив асептических условиях 5 г метанола. Полученную культуральную средуинокулировали засевали 3 2 об.предварительно полученной культуры,содержащей клетки Р 1 ачоЬасйег 1 цвйозаепз 1 з РБ(РЕВИ-Р Р 4058),выращенной на среде, имевшей аналогичный основной культуральнойсреде состав, при 37 С в течениео24 ч. Процесс культивирования проводили при 37 С в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне 7,0 путем прибавления 13 вес.Ъ раствора аммиака.Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения (выделения) микробных клеток. Клеткипромыли водой и сушили при 100 ОС24 ч. Получили высушенную биомассув количестве .4,5 г/л культурального бульона. Время генерации (размножения) данной культуры в логарифмическом периоде роста составило 1,4 ч,Анализ полученной биомассы показал,что клетки содержат 80 вес.Ъ сырого(неочищенного) белка,П р и м е р 2, Культуральную среду ( 1,2 л), имеющую состав, аналогичный примеру 1, поместили в сосуд-Ферментер емкостью 2,5 л и стерилизовали при 120 ОС 20 мин. Затем добавилив асептических условиях 12 г метанола. В полученную культуральную среду внесли в качестве посевного материала (инокулята 1 5 об. предварительно приготовленной культуры, содержащей клетки Р 1 ачоЬас 1 ег 1 цв йозаепз 1 з 05-1 (РЕВМ-Р 9 4058), полученнойпутем культивирования при 37 ОС в течение 20 ч на культуральной среде,имевшей состав, аналогичный примеру 1. Процесс культивирования проводили при 37 С в условиях аэрации и2,8 0,5 0,48 0,48 2,4 2 п 504 70 Сц 504 50 МаМо 042 Н 0 СоС 1 г." 6 НгО Мп 504 5 НгО Дистиллированная вода 1 л 10 18 20 25 30Ф 50 60 г Р 04Маг НР 04 (Н 4), 504Ма 50+ 7 Н,ОСаС 1 2 Н 0 Ре 504. 7 НО 1500 3200 3000 500 10020 65 перемешиваиия, поддерживая рй культуральной среды на уровне 7,0 пу-.тем добавления 13 нес, раствора аммиака. По истечении 20 ч с началапроцесса концентрация клеток в куль-.туральном бульоне составляла 4,5 г/л,К культуральному бульону добавляливодные растворы следующих солей металлов, мл/л культурального бульона: 10-ный водный раствор дигидрофосфата калия (ЕНгР 04) 185-ный воцный раствор моногидрофосфата натрия(ат НР 04)77 510-ный водный раствор сульфата магния(МДБ 04 7 НО)10-ный нодный растнор хлористого кальция (СаС 1 2 НтО) 3;51-ный водный .раствор сульфата двухналентного железа(Ре 504 7 Н 0) 51-ный водный растнор сульфата цинка2 п 504 7 НгО) 41-ный водный раствор сульфата медиСц 504 5 НгО)1-ный водный раствор сульфата марганца (Мп 804 5 НгО) 1,10,1-ный водныйраствор борной.кислоты (НВО ) . 20,1-ный водныйраствор хлористогокобальта (СоС 1 бН 0) 0,540По истечении 20 ч с начала культивирования в систему стали добавлять метанол таким образом, чтобы концентрация метанола в культуральном бульоне поддерживалась на уровне от 1 до 5 г/л. Количество метанола через 29.ч с начала процесса достигло 96 г/л культурального бульона. По истечении 29 ч с начала культиви рования культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток. Полученну:о биомассу клеток промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Получили 32 г высушенной биомассы клеток на 1 л культурального бульона. Анализ по. 55 казал, что зти клетки содержат 77 вес. сырого белка (протеинов),П р и м е р 3. Состав культу- ральной среды, мг. 100 мл культуральной среды поместили н колбу Сакагучи емкостью 0,5 л и стерилизовали при 120 С 15 мин. Затем добанили в асептических условиях 0,2 г метанола. В полученную культуральную среду внесли н качестве посевного материала (инокулята) 0,5 об. прекультуры, содержащей клетки Рэецйощопаэ ыаЕауащаепыэ 5-25 (РЕЯМ-Р Р 4100), которая была получена культивированием при 35 С н течение 24 ч на культуральной среде, имевшей состав,аналогичный описанному, но количество метанола составляло 0,5 нес Процесс проводили при 35 С 24 ч при встряхивании на качалке. ПолученНый культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток. Выделенную биомассу клеток промыли водой и сушили при 100 С 24 ч Получили 0,9 г высушенных клеток на 1 л культурального бульона. Время генерации (размнот жения) н логарифмическом периоде роста составило 1,5 ч, Анализ показал, что полученная биомасса клеток содержала 78 вес. сырого белка (суммарных белковых веществ).П р и м е р 4. 500 мл культу- ральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 3, поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120 С 1 Ь мин. Затем добавили и асептических условиях 5.г метанола. В культуральную среду внесли н качестве посевного материала (инокулята) 2 об. культуры, содержащей клетки Рэецдощопаэ ыаЕауаваепэ 1 э 8-25 (РЕВМ-Р 9 4100), полученной путем предварительного культивирования при 37 ОС в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав, Основной процесс культивирования проводили при 37 ОС в течение 20 ч, поддерживая рН культуральной среды на уровне 70 путем прибавления 13 нес. водного раствора аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью выделения микробных клеток. Клетки (биомассу) промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Получили 4,2 г высушенной клеточной биомассы на 1 л культу-, рального бульона. Время генерации (размножения) указанной культуры в логарифмическом периоде роста составило 1,6 ч. По данным анализа полученная клеточная биомасса содер(МН 4)г 504 3000Мй 304 7 Н,О 500СаС 1 г 2 НгО 100Ре 504. 7 Н. 0 20Еп 804. 7 НгО2,8Сц 504 5 НгО05ИагМо 04 2 Н 0 0,48.СоС 1 г бНгО 0,48Мп 504 5 НгО . 2 ф 4Дистиллиро-ванная вода 1.л О 15 100 мл культуральной среды поместили в колбу Сакагучи емкостью 0,5 ли стерилизовали при 120 С 15 мин.Затем добавили в.асептических условиях 5 г метанола. В полученную куль.туральную среду внесли в:качествепосевного материала 0,5 об. культуры, содержащей клетки Р 1 ачоЬасге т 1 ца щейЬапо 11 со 1 а М(РЕКМ-РМ 4098), .которую приготовили путем,танола составляло 0,5 об Основной процесс культивирования проводилипри 35 ОС 24 ч.при.встряхивании накачалке,Полученный культуральный бульонцентрифугировали с целью выделения 35микробных клеток. Клеткипромыливодой и сушили при 100 С 24 ч. Получили 0,85 г высушенной клеточной биомассы на. 1 л культуральиого бульона.Время генерации .(размножения) .40культуры в период логарифмическогороста составило 1,5 ч. По данныманализа содержайие суммарных белков(сырых протеинов) в полученной сухой биомассе составило.75 вес.,Н р и м е р 6. 500 мл культуральной среди, имевшей состав, аналогичный примеру Б, поместили в.стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120 С 15 мин.,Затем добавиЛи в асептических условиях 5 гметанола, В культуральную среду внесли в качестве посевного материала(инокулята) 2 об. культуры, содержащей клетки Р 1 ачоЬасг,ег 1 цв аеЬапо 1 хсо 1 а ВБ(РЕЕМ-Р Р 4098), полученной в результате культивации при37 ОС в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 37 С 20 ч в 60условиях аэрации и перемешивания,поддерживая рН культуральной среды на уровне 7,0 путем добавления.,13 вес.водного раствора аммиака.Полученный культуральный бульон цент рифугировали с целью отделения микробных клеток. Клетки промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Получили 4,2 г высушенной клеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения) данной культуры в период логарифмического роста составило 1,6 ч, Содержайие суммарных белков (протеинов) составило около 78 весП р и м е р 7, Состав культу-. ральной среды, мг:КНгР 04 1500 .ХагНРО 4 3200(ИН 4)г 504 3000МдЮ 4 7 НгО500СаС 11 2 НгО 100Ре 504. 7 НгО . 202 п 504 7 НгО 2,8Сц 504. 5 НгО 0,5Иа Мо 04 2 Н 0 . 0,48СоС 1 г бН 0 0,48Мп 804 5 Нр.О 2,4Дистиллированная вода 1 л500 мл культуральной среды поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали.при 120 С 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 5 г метанола Полученную культуральную среду инокулировали 2 об,.,культуры, содержащей клетки Рзецйощопаз Еуойоепз 1 з05-22(РЕЕМ-Р Р 4099), полученной в результате культивации при 37 фС в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 37 С в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне добавления 13 вес. водного раствора аммиака.Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения ( выделения ) микробных клеток. Клетки промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Получили высушенную клеточную биомассу в количестве 4,3 г на 1 л культурального бульона. Время генерации ( размножения) данной культуры в период логарифмического роста составило 1,5 ч, Полученная кле очная биомасса содержала 79 вес. суммарных неочищенных белков. П р и м е р 8. 1,2 л культураль ной среды, имевшей состав, авалогич. ный примеру 7, поместили в стеклянный ферментер емкостью 2,5 л и .стерилизовали при 120 С 20 мин, после чего добавили в асептических усЛО- виях 12 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали путем внесения в качестве посевного материала 5 об. культуры, содержа 3 О1 О 158312918 О,б 0,7 щей микробные клетки РзецйоаопазЕуо 1 оепз 1 з РБ(РЕВМ-Р 9 4099),приготовленной путем культивирова-,ния при 37 ф С в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 370 С в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне 7,0 путем использования 13 вес.водного раствора аммиака. По истечении 20 ч с начала процесса концентрация клеток в культуральном бульоне составляла 4,3 г/л,К культуральному бульону добавляли следующие водные растворы солей 15 металлов, мл/л бульона:10-ный водный раствор дигидрофосфатакалия (КНР 04 )185-ный водный раствор динатрийгидрофосфата ИаНР 04 ) 7710-ный водный раствор сернокислогомагния (МдБ 04 7 Н 0) 2510-ный водный раствор хлористого кальция (СаС 1 2 Н 0) 3,51-ный водный раствор сернокислогоЗОжелеза (РеБ 04 7 Н 0) 51-ный водный раствор сернокислогоцинка (2 пБ 047 Н 20)31-ный водный раст, вор сернокислоймеди (СцБО, 5 Н 0)1-ный водный раствор сернокислогомарганца(МпБО, 5 НО)400,1-ный водныйраствор борной кислоты (НВО) 2Спустя 20 ч после начала культивирования в культуральную систему до. бавили метанол таким образом чтобы его концентрация в культуральном бульоне сохранялась на уровне 1 5 г/л. Общее количество метанола, введенного в культуральную систему, 50 к концу 32 ч после начала гроцесса культивирования достигло 92 г/л куль" турального бульона. По истечении 32 ч с начала процесса культивирования культуральный бульон центрифугиро вали с целью отделения микробных клеток. Клетки промыли водой и сушили при 100 С. 24 ч. Получили 31 г высушенной клеточной биомассы на 1 л бульона. Анализ показал, что 0 полученная клеточная биомасса содержит 78 вес. неочищенных суммарных белков протеинов ).П р и м е р 9. Состав культуральной среды, мг: 65(ИН 4), БОМдБ 04 7 Н 20СаС 1 2 НйОРеБО, 7 НдО2 пБО, 7 НдОСцБ 04 7 Н 20МаМо 04 2 НОСоС 1 х 6 НОМпБ 04 5 Н ОДистиллированная вода 1 л П р и м е р 10, 500 мл культу- ральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 9, поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120 С 15 мин. Затем в культуральную систему ввели в асептических условиях 5 г метанола.Полученную культуральную среду инокулировали (засевали ) путем введения в нее в качестве посевного материала 2 об. культуры, содержащей клетки Рзеис 1 овопаз а 1 сЬепз 1 з ПБ(РЕЯМ-Р Р 4107), приготовленной путем культивирования при 37 С в течение 24 ч на аналогичной примеру 9 культуральной среде. Основной процесс культивирования проводили при 37 С в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне 7,0 путем введения 13 вес. раствора аммиака. 100 мл культуральной среды поместили в колбу Сакагучи емкостью 0,5 ли,стерилизовали при 120 С 15 мин,Затем добавили в асептических условиях 0,2 г метанола. В полученную культуральную среду ввели в качестве посевного материала 0,5 обкультуры, солеожащей микробные клетки Рзеийощопаз а 1 сЬ 1 епз 1 з ПБ(ГЕЙМ;Р Р 4107), приготовленнойпутем культивирования при 37 С втечение 24 ч на культуральной среде,имевшей аналогичный состав, но количество метанола в системе изменили до 0,5 вес., Основной процесскультивирования проводили при 37 Св течение 24 ч при встряхиванииферментационной колбы на качалке.Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения мик-робных клеток от культуральной жидкости. Полученную клеточную биомассу проьили водой и сушили при 100 С24 ч. Получили 0,88 г высушеннойклеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения ) данной культуры .в периодлогарифмического роста составило1,5 ч, Анализ полученной клеточнойбиомассы показал, что она содержит79 вес. суммарных неочищенных белков,150032003000500100202,80,50,480,482,4 1 л 100 мл культуральной среды поместили в ферментационную колбу Сакагучи емкостью 0,5 л и стерилизо- З 0 вали .при 120 ОС 15 мин. Затем ввели в асептических условиях 0,2 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали введением0,5 об.Ъ прекультуры, содержащей 35 клетки СогупеЬасг.ег 1 цв уавапаз 1 епз 1 з ПЯ(РЕкМ-Р Р 4106), которая была получена культивированием укаэанного щтамма при 35 С в течение 24 ч на культуральной среде, имев щей аналогичный укаэанному состав, но количество введенного в систему метанола изменили до 0,5 вес.Ъ. Куль тивирование проводили при встряхивании ферментационной колбы на качалке при 35 ОС в течение 24 ч. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток от культуральной жидкости. Выделенную клеточную биомассу промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Выход продукта составил 0,84 г Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток от культуральной:. жидкости. Полученную клеточную биомассу промыли водой и сушили при 100 С 24 ч. Выход высушенной клеточной биомассы составил 4,1 г на 1 л культурального бульона. Время генерации данной культуры в период логарифмического роста составило 1,6 ч, Анализ показал, что полученная клеточ ная биомасса содержит 7 вес.Ъ неочищенных суммарных белков (протеинов).П р и м е р 11. Состав культу- ральной среды, мг:КН РО 415Над НР 04РН 4),504МЦ 504 7 П.ОСаС 1 2 НтоГе 504 7 Н 20 20Еп 504 7 НОСц 504 БНОИааМоС 4 2 Н 20СаС 12 бахоМп 504. 5 НО 25Дистиллированная вода высушенной клеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерацииразмножения ) данной культуры в период логарифмического роста составило 1,5 ч. Анализ показал, что полученная биомасса микробных клеток содержит 76 вес,Ъ неочищенных суммарных белков протеинов).П р и м е р 12. 500 мл культу, ральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 11, поместили в стеклянный ферментеремкостью 1 л и стерилизовали при 120 С 15 мин. Затем ввели в асептических условиях 5 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали путем введения в качестве посевного материала 2 об, культуры, содержащей клетки СогупеЬассег 1 цв уавапаз 1 епз 1 з ПЯ-;РЕЮ 1-Р Р 4106), которую получили путем культивирования указанного штамма при 37 ф С в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей состав, аналогичный указанному выше. Основное культивирование проводили в усло. виях аэрации и перемешивания культурального бульона при 37 С в течение 20 ч, поддерживая рН культурального бульона на уровне 7,0 путем использования 13 вес.Ъ водного аммиака.Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток от культуральной жидкости. Выделенную клеточную био" массу промыли водой и сушили при 100 О С 24 ч. Получили 4,0 г высушенных клеток на 1 л культурального бульона, Время генерации культуры в период логарифмического роста составило 1,6 ч. Анализ показал, что полученная клеточная биомасса содержит 77 вес.Ъ неочищенных суммарных белков.Предлагаемый способ позволяет полу" чить биомассу (содержание сырого протеина до 80 ) в количестве до 42,2 по метанолу в отличие от известного способа, в котором выход биомассы составляет до 40 (содержание сырогб протеина 70-80). Результаты культивирования с использованием данных штаммов приведены в табл. 13.6,9 80 255 110 5,7 78 105 120 70 78 120 220 То же 7,2 76 100 6,2 77 145 105 6,8 2.50 100 5,7 79 108 72 90125 6,0 77 ВПримечание: Ч - рабочий объем, 5 - концентрация метанола, О - скорость разбавления, Х -концентрация клеток в ферментерз, У - выход клеток по метанолу, ОХ - производительность, Р - содержание сырого клеточного протеина ( определялось путем измерения содержания азота, т.е. содержание азота, Вх 6,25), О - количество подаваемого кислорода, й - количество подаваемого азота. Тираж 523 Заказ 3239/53 Подписное филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Р 1 аоЬасйег 1 цв Созаепз 1 з РБ0,509 39,0 Р 1 ауоЬасСег 1 цв ве 1 ЛапоИсо 1 аРЯ"16 Рзецйовопаз чаЕауаваепз 1 з РЯ0,49 Рзецдовопаз Еуо 1 бепз 1 з РЯ 0,500 Рзецйовопаз а 1 сЛ 1 епз 1 з РЯСогупеЬасгег 1 цв уавапаз 1 епз 1 зРБР 1 ауоЬасйег 1 цш гозаепз 1 з РЯ НауоЬасйег 1 цв вегЛапо 11 со 1 аРБРзецс 1 овопаз юаЕауаваепз 1 з РЯРзецдовопаз Еуо 1 оепз 1 з РРзецйовопаз а 1 сЛ 1 епз 1 з РЯСогупеЬазгег 1 цш уашапаз 1 ецз 1 зРЯ-З 1 0,22 32,8 0,437 0,19 32,5 0,448 0,40 17,1 0,435 0,34 16,9 0,438Изобретение относится к микробиологической промышленности, аименно к способу получения бактериальной биомассы, использующейся вкачестве корма, пищевых продуктови т,д путем культивирования бактерий на питательной среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода,Известен способ получения биомассы путем культивирования бактерийрода Сог пеЬас 1 ет 1 ыщ и Рэедйощопаэна питательной среде, содержащей ме.танол в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, необходимые минеральные соли, стимуляторы роста, при аэрации среды с последующим отделением и сушкой полученной биомассы Ь 1),Выход бактериальной биомассы пометанолу составляет 40 вес. 3, содержание сырого протеина - 70-80.Цель изобретения - повышение выхода биомассы с высоким содержаниемсырого протеина.Поставленная цель достигается25тем, что согласно способу получениябиомассы, предусматривающему культивирование продуцирующих биомассубактерий на питательной среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, источниказота и минеральные соли, н условияхаэрации среды с последующим отделением и сушкой биомассы, в качестве бактерий, продуцирующих биомассу,используют штамм Г 1 ауоЬас 1;ег 1 шп Соэаепэ 1 э БЯ(РЕИ 4-Р Р 4058) илиРзеыйощопаэ ха 1 ауащаепэ 1 э 05-25(1"ЕКМ-Р Р 4099), или Рэепйощапаза 1 с 111 епэ 1 з 05-26 (РЕВМ-Р Р 4107),или СогупеЬас 1 ег 1 цщ уавапаз 1 епэ 1 эП(1 Е 1 Ц 1-Р Р 4106),Используемые в предлагаемом способе штаммы депонированы в Науч:оо-с следовательском институте ферментации Агентсва проььшленно-научныхразработок и технологических процессов в Японии.Штаммы имеют следующие характерис тики,Мтамм Р 1 ачо(,ас 1 ат 1 цщ 1 озаепэ 1 з118-1 (1 ЕйМ-Р Р 4058) .Иорфологические признаки;Штамм культивировали на питательной среде и питательном агаре при37 С в те ение 3 дн.Форма и размер клеток - палочкиот 0,5-0,75 до 1,6-.2,2 мк,1 солонии клеток единичные или пар Подвижности нет,.Спор нет,Окрашиваемость по Граму - отрица.тельная. Кислоустойчивость - отрицательная,Рост (развитие) бактерий на различных культуральных средах:На чашках Петри а питательнымагаром - интенсивный рост при 37 дСв течение 3 дн, образовавшиеся колонии клеток имеют круглую форму диаметром 2-3 мм, выпуклую с однородной структурой, гладкую, ровную поверхность с целыми (неповрежденными) краями, желтовато-белые илимолочно-белые (беловатые), блестящие, искрящиеся, полупрозрачные(просвечивающие) и слизеподобные.На чашках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при37 С в течение 3 дн, колонии клеток -круглые диаметром 2,0-2,5 мм, выпуклые с гладкой поверхностью и ровными цельными краями, белые или опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные,На скошенном питательном агаренитевидный рост при 37 ОС в течение3 дн, колонии клеток имеют гладкуюровную поверхность, умеренно выступающую и окрашенную в желтоватобелый или молочно-белый цвет с блестящим глянцем, полупрозрачные и слизеподобные,На скошенном метанольном агаре -нитевидный рост при 37 С в течение3 дн., колонии клеток имеют гладкую1 ровную поверхность, умеренно выступающую вперед и окрашенную в белыйцвет с опалесцирующим оттенком иблестящим глянцем, полупрозрачные(просвечивающие) и слизеподобные.На питательном бульоне - интенсивный рост при 37 С в течениеЗ,цн, культура становится мутной,образуется осадок (отстой), на поверхности образуется белая кольцеобразная тонкая пленка (пелликула).На водном пептонном бульоне - интенсивный рост при 37 С в течение3 дн, культура становится мутной,Образуется осадок (отстой), на поверхности образуется кольцеобраэнаяпелликула.На метанолсодержащем бульоне интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн, культура мутнеет, образуется осадок, на поверхности образуется кольцеобразная пелликула.На питательном бульоне с палочками желатина - рост на поверхности ини протекающий до глубины 2-3 мм при 37 С в течение 3 дн,На питательном желатиновом бульоне (на палочках желатина) - поверхностный рост при 30 С в течение 5 дн с образованием осадка, при этом желатин разжижается.+ (слабая) + (слабая) + (слабая) д-Арабинозад-Ксилозад-Глюкозад-Маннозад-фруктозад-ГалактозаМальтозаСахарозаЛактозаТрегалоза Д-СорбитД-МаннитИнозит Глицерин Крахмал Продуцированиегаза Сахар+ (слабое) + (слабое) + (слабое) + (слабое) + (слабое) Д-Галактоза МальтоэаСахарозаЛактозаТрегалоза 60 65 На лакмусовом молоке - при 37 Собразуется кислота, культура приобретает красный цвет и коагулирует.Биохимические признаки:Нитраты не восстанавливает.Реакция денитрификации - положительная.Ретикулярная реакция (Мй тест)отрицательная.ЧР-тест - отрицательная реакция.Индол не продуцирует. 0Сероводород не продуцирует,Крахмал не гидролизует.Цитраты (в среде Козера) не утилиэирует., Утилизирует неорганический азот, 15аммонийные соли и нитраты.Не продуцирует рХ-пигмент (в средах А и В Кинга).Уреазная реакция - положительная.Оксидазная реакция - положительная.Каталазная реакция - положительная.Рост на метанолсодержащем бульоне при рН 5-9 (оптимальный диапазонрН б"8). При рН 4 и 10 .роста нет.Хороший рост наблюдается в диапазоне температур 5 - 44 С (оптимальный диапазон 25 - 42 С); при 45 Сроста нет,Отношение к кислороду - азробнаякультура.0-Г тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболизируетглюкозу (слабое образование кислоты).Продуцирование кислоты и газа из 35сахаров (при использовании водногопептона, содержащего сахар в концентрации 1, при 37 С в течение 10 дн)представлено в табл. 1.Таблица 1 4 р Продолжение табл, 11 Ассимиляция сахаров (при использО вании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации 1 при 37 С в течение 10 дн) представлена в табл, 2,Штамм выделен иэ почвы.Метанолсодержащая агаровая средаиспользовавшаяся в укаэанных опытах(тестах) по культивации бактериЯ данного штамма, имела следующий состав,мг:20000 АгарДистиллированная вода 1 л 35 На скошенном метанолсодержащем агаре - нитевидный рост при 37 С в течение 5 дн., колонии клеток имеют ровную, гладкую поверхность и умеренно выступающую (выпуклую) форму, края цельные, молочно-опалесцирующий цвет и блестящий глянец, полупрозрачные и слиэеподобные. 60 Культуральную среду стерилизовали при 120 ОС в течение 15 мин, после чего прибавили в асептическихусловиях 20 г метанола.Для приготовления метанолсодержащего бульона использовали аналогич.ную среду, но без добавления агара,а количество метанола снизили до 5 г.Штамм Рзецдощопаз ыаКауаваепв 1 зРЯ - 25 (ЕЕИ 1-Р Р 4100),Морфологические признаки,"Штамм культивировали на питательном бульоне и питательной агаровой15среде при 37 С в течение 3 дн.Форма и размер клеток - палочкиот 0,3-0,4 до 2,0-2,2 мк.Колонии клеток единичные или парные, 20Подвижные с полярно расположенными жгутиками.Спор нет,Окрашиваемость по Граму - отрицательная. 25Кислотоустойчивость - отрицательная,Рост бактерий на различных куль -туральных средах:На чашках Петри с питательным 30агаром - интенсивный рост при 37 Св течение 3 дн., колонии клеток круглой формы диаметром 3-4 мм с шероховатой поверхностью, дольчатыми,разделенными на лопасти, краями(кромками) и молочно-желтовато-белой окраской, меловые, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные,На чашках Петри с меЛнолсодер -жащим агаром - интенсивный рост при37 С в течение 5 дн колонии клеток диаметром 3-4 мм, выпукло-выступающие с глубоким г:упком (углублением в центре), грубая, шероховатая поверхность, цельные края, опалесцирующий молочно-белый цвет иблестящий глянец, полупрозрачныеи слизеподобные,На скошенном питател ном агареОнитевидный рост при 37 С в течение 503 дн колонии клеток имеют гладкуюповерхность и умеренно выступающую(выпуклую) форму, волнообразные илидольчатые (разделенные на лопасти)края, молочный желтовато-белый цветс тускловатым блеском, полупрозрачные и слизеподобные. На питательном бульоне - умеренный рост при 37 С в течение 3 дн.,не образуется никакого осадка илиотстоя, на поверхности образуетсяпелликула.На встряхиваемом питательномбульоне - интенсивный рост при 37 Св течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная (просвечивающая).На иептонном водном бульоне(встряхиваемом) - интенсивный ростпри 37 С в течение 3 дн., культурастановится мутной, образуется осадок,На метанолсодержащем бульонеинтенсивный рост при 37 С в течение 3 дн культура становится мутной, образуется осадок (отстой),на поверхности образуется кольцеобразная пелликула, полупрозрачная.На метанолсодержащем бульоне(встряхиваемом) - интенсивный ростпри 37"С в течение 3 дн., культурастановится мутной, образуется осадок (отстой), полупрозрачная.На питательном бульоне (палочковом) - рост на поверхности или протекающий в глубину на 1-3 мм при37 С в течение 3 дн поверхностьимеет молочный желтовато-белый цвет,На питательном желатиновом бульоне (иалочковом) - поверхностный ростопри 30 С в течение 5 дн., с образованием осадка, желатин расжижается.На лакмусовом молоке - при 37 Скультура коагулирует.Биохимические признаки:Нитраты восстанавливает.Ееакция денитрификации - отрицательная.Ретикулярная реакция (в мальпигиевых тельцах) - отрицательная (Мк-тест),Л в те - положительная реакция,Нндол не продуцируетСероводород не продуцирует.Крахмал гидролизует.Утилизирует цитрат (среда Коэера).Усваивает неорганический азот.Ассимилирует аммонийные соли, нитраты,Не продуцирует пигмент (среды А.и 13 Кинга 1. уреаэная реакция - положительная,Каталазная реакция - положитель"ная,Иптергалы температуры и рН дляроста бактерий данного штамма наметанолсодержащем бульоне ваоьируются (рН регулируют путем добавления водного раствора гидроокиси нат"рия или соляной кислоты). Наблюдается хороший рост при рН от б до 9.При рН 5 и 10 не наблюдается никакого роста. Хороший рост в диапазоне.+. (слабая) Лактоэа Трегалоэа30 Д-Сорбит Д-МаннитИнозит Т а б л и ц а 3 ГлицеринКрахмал Нрба 1(Н- Продуцирование рование кислоты газа Сахар Штамм выделен из.почвы.Метанолсодержащая агаровая среда(использовавшаяся в тестах по культивации бактерий указанного штамма, имела следующий состав, мг:25 Н 2 РО 1500Иаа НР 04 3200Ассимиляция сахаров (при использа ванин сахара вместо метанола в ме танолсодержащем бульоне в,концентрации 0,5 вес, В при 37 С в течение 10 дн.) показана в табл. 4,Таблица 4 50 е.ПодвижностиСпор нет.:Скрашиваемотельная.Кислотоустой т. Арабин+ (слабая) 65 ая Д-фруктоэа Д-Галактоэ ост бактери льных среда температур от 5 до 40 фС. При 41"С никакого роста не происходит,0-Р тест (по методу Хьюго Лейфсоф на), - окислительно метаболизирует глюкозу.Отношение к кислороду - азробная . культура.Продуцированиа кислоты и газа . иэ сахаров (при использовании пептонной волы, содержацей сахар в,кон-. центрации 1, при 37 фС в течение 10 дн.) представлено в табл. 3. й-АрабинозаД-КсилозаД-ГлюкозаД-МаннозаД-ФруктозаД-ГалактозаМальтозаСахарозаЛактозаТрегалозаД"СорбитД-МаннитИноэитГлицеринКрахмал Культуральную.среду стерилизова . ли при 120 фС в течение 15 Мйн; после чего добавили в асептических условиях 20 гметанола.для полученияметанолсодержащего бульона приготовили аналогичную среду, но в ее составе совсем не использовали агар и количество метанола сократили до 5 г,Штамм Р 1 ауоЬасйет 1 цщ щегЬапо 13.- со 1 а ЭЯ(,РЕВМ-Р 9 4098).Морфологические признаки;Штамм культивировали на питательном бульоне или питательной агаро- вой среде при 37 фС в течение 3 дн.форма.и размер клеток - палочки от 0,5-0,7 до 1,5-1,8 мк.Колонии клеток единичные или пар1015831 Сахар Продуц ровани кислот Продуцированиегаза Л-РрабинозД-Ксилоза лабое)+ (слабое) На чашках Петри с питательнымагаром - интенсивный рост при 37 фСв течение 3 дн., колонии клетокимеют круглую форму диаметром 4-5 ммвыпуклые, однородная, равномернаяструктура, гладкая поверхность,края целые, окраска желтовато-коричневая, блестящая, полупрозрачная(просвечивающая) и слизеподобная.На чашках П три с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост 1 Спри 37 фС в течение 5 дн., колонииклеток имеют круглую форму диаметром 2-3 мм, выпячивание носит характер выпуклости, гладкая ровная поверхность, целые края, молочный 15желтовато-белый цве. и блестящий глянец, полупрозрачная и слиэеподобная.На скошенном питательном агаренитевидный рост при 37 С в течение3 дн., колонии клеток имеют умеренновыступающую форму с шероховатой поверхностью и целой кромкой, желтовато-коричневые блестящие, полупрозрачные и слиэеподобныа.На скошенном метанолсодержащемагаре - нитевидный рост при 37 Св течение 5 дн колонии клеток умеренно выпяченные (выступающие) сгладкой поверхностью и целой кромкоймолочно-желтовато-белые, блестящие, 30полупрозрачные (просвечивающие) ислиэеподобные.На питательном бульоне - умеренный рост при 37 С в течение 3 дн.,образуется осадок, на поверхности 35образуется пслликула,На питательном бульоне (встряхиваемом) - интенсивный рост при37 С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок,полупрозрачная.На пептонной воде (встряхиваемой) - интенсивный рост при 37 С втечение 3 дн., культура становитсямутной, образуется осадок.На метанолсодержащем бульонеинтенсивный р,ст при 37 С в течение3 дн., культура становится мутной,образуется осадок, на поверхностиобразуется кЬльцеобразная пелликула,полупрозрачная.50 На метанолсодержащем б,льоне (встряхиваемом ) - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн., культураановится мутной, образуется осак, полупрозрачная,На питательном бульоне (в виде столбиков) - рост на поверхности или протекающий до глубины 3-5 мм при 37 С в течение 3 дн." ,поверх ность желтовато-коричневая.На питательном желатине (в виде столбиков ) - при 30 С в течение 5 д не происходит никакого разжижения желатина. оНа лакмусовом молоке - пои 37 Скультура коагулирует,Биохимические признаки:Нитраты восстанавливает.Реакция денитрификации - положительная.Ретикулярная реакция (МК-тест)отрицательная.ЧР-тест - положительная реакция.Продуцирует индол и сероводород.Крахмал гидролизует.Утилизирует цитраты (среда Козера), аммонийные соли, нитраты, неорганический азот.Не продуцирует пигмент (среды Аи В Кинга),Уреазная реакция - положительнаяОксидазНая реакция - положительная.Каталазная реакция - положительная.Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем бульоневарьируют (рН регулируют путем прибавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты), Хороший рост наблюдается при рН от 5до 9 (предпочтительный диапазон рНб - 8), причем при рН 4 и 10 ростане наблюдается, и температуре в диапазоне от 15 до 40 С (температурный интервал от 25 до 40 С является предпочтительным), при 42 С роста не происходит.Отношение к кислороду - аэробнаякультура.О-Г тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболиэируетглюкозу.Продуцирование кислоты и газа иэсахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара1 вес. % при 37 С в течение 10 дн.)приведено в табл. 5.Таблица 5+ (слабая) + (слабая) 60 65 Ассимиляция сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации 0,5 вес, Ъ при 37 С в течение 10 дн.) показана в табл. б.Таблица б Штамм выделен из почвы,Метанолсодержащая агаровая средаиспользовавшаяся в тестах по культивации бактерий указанного штамма,имела следующий состав, мг:КН РО 4 1500ИаНРО 4 3200РН,а) БО 4 3000МрЯС 3 7 НО 500СаС 1 2 НО 100РеЯ 04 7 НтО 102 пЯО 4 7 НО 1,4СиБО БНО 0,25МаМоО 2 Н О - 0,24СоС 1 6 Н О 0,24Мп 304 5 Н О 1,2Агар 20000Дистиллированная вода 1 л Культуральную среду стерилизовали при 120 фС в течение 15 мин, пос 5 15 25 40 45 50 55 ле чего прибавили в асептическихусловиях 20 г метанола.Метанолсодержащий бульон имеланалогичный состав, но не испольэовали агар, а количествометаноласократили до 5 г.Штамм Рэеидовопаэ Еуо 1 оепэ 1 эРЯ(РЕВМ-Р 9 4099).Морфологические признаки:Штамм культивировали на питатель"ном бульоне и питательной агаровойсреде при 37 С в течение 3 дн.форма и размер клеток - палочкиот 0,5 до 1,7-1,8 мк.Колонии клеток единичные или парные.Подвижные с полярно расположенными жгутиками.Спор нет.Окрашиваемость по Граму - отрицательная.Кислотоустойчивость - отрицательная.Рост бактерий на различных культу-1ральных средах:На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при 37 фС в течение 3 дн., колонии клеток .круглыедиаметром 3-4 мм с ровной глакойповерхностью и цельными или волнообразными краями ( кромкой), молочножелтовато-белые, меловые, .полупроз"рачные и слизеподобные,На чашках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при37 С в течение 5 дн. Колонии клетоккруглые диаметром 3-4,5 мм, выпуклой формы с шероховатой поверхностью и целыми краями, опалесцирующиемеловые, полупрозрачные и слизеподобные.На скошенном питательном агаре -.нитевидный рост при 37 С в течение3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные с гладков ровной поверхностьюи целыми или волнообразными краями,молочно-желтовато-белые, меловые, полупрозрачные просвечивающие ) и слиэеподобные.На скошенном метанолсодержащемагаре - нитевидный рост при 37 Св течение 5 дн , колонии клеток уме.ренно выпяченные с шероховатой по".верхностью и волнообразными или дольчатыми разделенными на лопасти краями, опалесцирующие, наблюдается обра-.зование бледно-розового пигмента,очень тусклый блеск (глянец), полу-.прозрачные и слиэеподобные. На питательном бульоне - умеренный рост при 37 С в течение 3 дн образование-осадка не наблюдается, на поверхности образуется пелликула.На питательном бульоне (встряхива. ние в процессе культивирования) интенсивный рост при 37 ОС в течение 3 дн., культура становится мутной,+(слабое) н акци оложитель ала ая(слаба кто кто льтоза наблюдается образование осадка, полупрозрачная.На пептонном водном бульоне(встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн культура становится .мутной, образуется осадок (отстой).На метанолсодержащембульоне - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн., культура становится мутной, 1 О образуется осадок, на поверхности образуется тонкая пелликула, культура полупрозрачная.На бульоне, содержащем метанол в сочетании с минеральными солями 15 (встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная. 2 ОНа питательном бульоне (в виде столбиков) - при 37"С в течение 3 дн, рост происходит лишь на поверхности столбиков, поверхность молочно-желтого цвета.2 еНа питательном желатиновом бульоне (в виде столбиков) - поверхностный рост при 300 С в течение 5 дн. с образованием осадка, желатин раз" жижает.На лакмусовом молоке при 37 еС 30 культура коагулирует.Биохимические признаки:Восстанавливает нитраты.Реакция денитрификации - отрицательная, 35Ретикулярная реакция,(МК-тест) отрицательная.ЧР-тест - положительная реакция.Не продуцирует индол и сероводород. 4 ОГидролиэирует крахмал.Утилизирует цитраты (среда Коэера), неорганический азот, аммонийные соли, нитраты.Не продуцирует пигмент (среды А и В Кинга).Не продуцирует пиУреазная реакция - голожительная.Оксидаэная реакция - положительТемпературу и рН для роста бактерий на метанолсодержащем буль 9 не варьируют (рН регулируют путем добавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты). Хоро ший рост наблюдается при рН от 5 до 9 (предпочтительный диапазон рН б - 8). При рН 4 и 10 роста не проис ходит, Хороший рост наблюдается при температуре в диапазоне от 5 до 45 С, (предпочтительный диапазон 25 - 42 С). При 48 С роста нет.Отношение к кислороду - аэробная культура. О-Е тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболизирует глюкозу.Продуцирование кислоты и газа иэ сахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара 1 вес. 3 при 37 фС в течение 10 дн.) представлено в табл. 7. Ассимиляция сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концент рации 0,5 вес.Ъ при 37 С в течение 10 дн.) показана в табл. 8,Таблица 8Продолжение табл, 8 СахарозаЛактозаТрегалоэа Д-Сорбит Д-Маннит Иноэит Глицерин Крахмал 15 20 Штамм выделен иэ почвы.Метанолсодержащая агаровая среда,использовавшаяся при проведении тес-тов по культивации, имела следующий 25состав, мг: ЗО 35 40 Культуральную среду стерилизовали при 120 С в течение 15 мин, после чего прибавили в асептических условиях 20 г метанола.Метанолсодержащий бульон имел аналогичный состав, однако без введения агара, а количество метанола сократили до 5 г.Штамм Рэецс 1 ощопаэ а 1 сй 1 епэ 1 э РБ(РЕКМ-Р Р 4107).Морфологические признаки:Штамм культивировали на питатель-, ном бульоне и питательной агаровой среде при 37 С в течение 3 дн.Форма и размер клеток - палочки от 0,3-0,4 до 0,75-1,0 мк.Колонии клеток единичные или парные. 45 50 55 Подвижные с полярно расположенными жгутиками. 60Спор иет.Окрашиваемость по Граму - отрицатальнаяКислотоустойчивость - отрицательная,65 КНРОйадНР 04(%14) 504Ма 504 7 НОСаС 31 2 Н 0Ее 504 1 НОЕп 504 7 НОСы 504 5 Н 20ИаМо 04 2 НОСоС 1 6 Н 20Мп 504 5 НгоАгарДистиллиро= в "ванная вода 150032003000500100101,40,250,240,241,2200001 л Рост бактерий на различных культуральных средах:На чашках Петри с питательным агаором - интенсивный рост при 37 Св течение 3 дн., колонии клеток круглой формы диаметром 4-6 мм с выпуклым выпячиванием горбообразной формы, гладкой поверхностью и целымиили дольчатыми разделенными налопасти краями, молочные, желтовато.белые, блестящие, полупрозрачныеи слиэеподобные,На чашках Петри с метанолсодер"жащим агаром - интенсивный рост приО137 С в течение 5 дн., колонии клеток круглые диаметром 2-3 мм с гладкой поверхностью и целыми краями,опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и слиэеподобные,На скошенном питательном агаренитевидный рост при 37 С в течение3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные с гладкой поверхностью ицелыми или волнообразными краями,молочные, желтовато-белые, блестящие, полупрозрачныепросвечивающие)и маслянистые..На скошенном метанолсодержащемагаре - нитевидный рост при 37 С втечение 5 дн., колонии клеток умеренно выпяченные выпуклые) с гладкойповерхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и маслянистые.На питательном бульоне - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн.онаблюдается образование осадка, культура полупрозрачная, на поверхностиобразуется пелликула.На питательном бульоне (встряхива.ние в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37 С в течение3 дн., культура становится мутной,образуется осадок, полупрозрачная.На пептонном водном бульоне(встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37 Св течение 3 дн., культура становитсямутной, образуется осадок (отстой).На метанолсодержащем бульоне - интенсивный рост при 37 С в течение3 дн., культура становится мутной,образуется осадок, .на поверхностиобразуется тонкая кольцеобразнаяпелликула, полупрозрачная,На метанолсодержащем бульоне(встряхивание в процессе культивифрования) - интенсивный рост при 37 Св течение 3 дн., культура становитсямутной, образуется осадок, полупрозрачная.На питательном бульоне (в чидестолбиков) - рост на поверхностиили протекающий до глубины 2-3 ммпри 37 С в течение 3 дн., поверхностьмолочно-белого цвета.На питательном желатиновом бульоне (в виде столбиков) - поверхност