Способ получения вещества кs-2-а, обладающего противоопухолевым и антимикробным действием

Номер патента: 897099

Авторы: Итуро, Накао, Тосикацу, Фудзио, Хироси

ZIP архив

Текст

(31) 52-106321 (831 Япония А 61 К 31/00 3 Ьоударотюный кокнтвт СССР ао делаи нзобретеннй н открытнй(, Япония ) Иностранная бирма фКирин Сиграм Лимитед ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕПЕСТВА К 5 ОБЛАДАЧЦЕГО ЧРОТИВООПУХОЛЕВ:П И ЛНТИМ 11 КРОБНЫМ ДЕ 11 СТВИЕМ носится к микробио -Изобретеогической омьппленности и касае еств, обладающих проти и антимикробным дейстполучения в воопухолевы обладающегонтимикробным Целью изобретения является пол ение вещества К 5-2-Аротивоопухолевым и а деиствием.Цель достигается тем, что штаммОаеда 1 еа 01 с 11 пзП К 500 6(ГЕ 11 М-Р М 3993 лепт.1 пОз едодез К 51.Е 7(ГЕЙМ-Р М 399 Й) или 1.еп 1 пцз едодезК 51.Е 28 (ГЕРМ-Р 11 Й 196) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при25 С и экстрагируют целевой продуктиз биомассы горячей водой или 57.-нымводным раствором хлористого натрия при 80-100 С при перемешивании.В качестве питательной среды используют любую обычную среду, которая содержит глюкозу, крахмал, органические кислоты, в качестве источника углерода - полипептон, дрожжевой экстракт, мочевину, в качестве источника азота - витамин и неорганические соли, для лучшего эффекта до-, бавляют кукурузный экстракт или бар ду.Питательную среду подвергают Фильтрованию или центрифугированию. Полученный мицелий подвергают затем экстракционной обработке. Целесообразно экстракционной обработке подвергать тонко измельченный полученный мицелий с использованием для этого горячей воды или разбавленных водных раст воров соли при 60-130С, предпочтительно от 80 до 100 С, причем такие растворы содержат приблизительно 5 Х хлористого натрия. Такую экстракционную обработку удобно проводить с пер ремешиванием в течение примерно от5 мин до 3 ч, предпочтительно в течение 30-60 мин. После отделения твер-; дого материала экстракт, если это необходимо, подвергают осадительной об-; об работке с использованием гидрофильно-,20 19 897099 П р и м е р 12 .экспериментальный ). Микроорганизм Рзецдопопаз аегц.9 поза, выделенный из мочи больного лейкемией, подвергают культивированию при 37 ф С в течение 24 ч, после э чего клеточную массу суспендируют в дистиллированной воде в концентрации 10 вирусов/мл с последующим заражением путем инъекции в хвостовую вену 26 мьппей ОО (самки весом по 20 г в ф возрасте 6 недель) в дозировке по 0,1 мл/особь. За 24 ч до инъекционного заражения в организм мышей той группы, которая предназначена для леТаблица 7 Число дней, прожитыхживотными после заражения Средняя продол- жительЧисло Вьщиваевыжив- мость жиших в вотных,7 теченость жизни,дни ние20 дней М2; 2; 3; 3; свьгше 14, Свышесвыше 14; 14; 14; 14; 10,7свыше 14; 14; 14; 14,150 10 7 2 1; 1; 1; 1; 2; 2; 3; 2,3 03; 4;(контрольный эксперимент) П р и м е р 13 (экспериментальный). Непосредственное антибактериальное действие вещества К 5-2-А исследуют дисковым пульпо-диФФузионным методом с использованием различных бактерий и водного раствора веществаК 5-2-А концентрацией 1000 мкг/мл. Каквидно из данных таблицы, веществоК-А не проявляет непосредственнойантибактериальной активности.Ниже приведены значения минимальной ингибирующей концентрации ( ГПК )использованных микроорганизмов.Рзецдопопаз аегц 9 поза, мкг/мл Свыше 000К 1 еЬз 111 а рпеолопае,мкг/мл50.1 ы,ег 1 а щопосуФо 9 епез, мкг/млЕзсЬегсеа со 11,мкг/мп5 сару 1 ососсцз ацгецз 209-Р, мкг/мл Свыше 1000Сапдса а 1 Ьсапз,мкг/мп и То же Доза вещества Число К 5-2-А, мг/кг осо- бей чения, интраперитонеально вводят по0,5 мл водного раствора, содержащего150 мг/кй вещества К 5-2-А, тогда какв организм животных контрольной групы вводят только по 0,5 мг Физиологи.ческого раствора поваренной соли интраперитонеально) . Отмечают число животных, которые выжили в течение 20дней после их заражения, и затем определяют степень выживаемости,в процентахПолученные результаты сведень втабл. 7Сапд 1 да гор 1 са 11 з,мкг/млСапс 1 са рзецсойгорса 11 з, мкг/млСапсса цй 1 з,мкг/мл5 ассЬ егопусез сегечза 1 Вг, мкг/млНапзепц 1 а апопа 1 а,мкг/млРгойецз ОХ, мкг/млВас 111 цз зцЬй 11 з,мкг/мл5 Ь 19 е 11 а зоппе 1,мкг/мл5 агс 1 па 1 цсеа, мкг/млП р и и е р 14 (экспериментальный)В ходе проведения экспериментамышей ОО весом 14-16 г заражают введением в их организм 1 пСгапаОе 11 увирусов гриппа и лечат внутривеннымили пероральным введением веществаК 5-2-А в дозировке 200 мг/кг. В ходепроведения контрольного эксперимента в организм контрольных животных21 897099 22 интраперитонеально вводят по 50 мг/кг 1 ч до заражения мьппей вирусом, одновиразола или 0,5 мл физиологического временно с их заражением вирусом по раствора поваренной соли. Лалее оп- истечении 1, .3 и 6 ч после их заражеределяют число дней, прожитых живот- ния и затем дважды в день в течение ньви и степень их выживаемости в про последующих 4 дней. В качестве виру- центах. Как вещество К 5.-2-А, так и са гриппа используют адаптированный виразол вводят в организм в виде со- к мышам вирус гриппа штамма А /Кума- ответствующих растворов в физиологи- мото/У/Н / в 10 дозах ОУ ческом растворе поваренной соли в об- Полученные при этом результаты щей сложности 15 раз, а именно за 6 представлены в табл. 8.Таблица 8 Лекарственное Способ введения Число Средняя продол- Выживаесредство в организм особей жительность, дни мость мышей, Е Интраперито Свыше 20неально ВеществоК 5-2-А,200 мг/кг То же 25 Свыше 1920 Свьппе 16,9 32 Перор ально 30 Интраперитонеально Виразол, 50 мг/кг Контрольныйопыт 0 0 50 9,2 50 9,2 Интраперитонеально Полученные таким образом результа - ты сведены в табл. 9.Предложенный способ позволяет получить вещество, обладающее противоопухолевым и антимикробным действием. П р и м е р 15 ( экспериментальный). В ходе проведения данного эксперимента исследуют токсичность вещества К 5 -2-А,Таблиц а 9 ьный спося, мг/кг Подопытн животное утр нно нтраперитонеалный способ вве ия, мг/кг Перор введе едени оргаз г/к 875 Свьппе 25 Свыше 200 Мьппь, 1.О 208БОКрыса,.О Морскаясвинка,.О Свьппе 600 Свыше 2000 ФормулСпособ получ ющегу противооп ным действием,что штамм Оаеда 1 еа д 1 с 11 п 6 (РЕЮ-Р М 3993)1.еп 1 пц 1.Е 7 (ГЕЙМ-Р й 3994) илиедодез К 51 Е 28 РЕВИ-Р и зобретенияния вещества, обладаухолевым и антимикробо тли ч ающийс я тем з 11 К 5 ОО едодоз К .епй 1 пцз897099 24 23 Составитель С, Малютина Редыстор М. Дыпын Техред Т.Маточка . Корректор М. Иароши Заказ 11741/46 тираж 716 Подписное. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, ЖРабская наб.д д. 4/5 Филиал ППП "Патент",. г. Ужгород, ул. Проектная, 4й М 96) культивируют в питательнойсреде, содержащей источники углерода,азота и минеральные соли, в азробных условиях при 25 С и экстрагируют целевой продукт из биомассы горячей водой или 53-ным водным растворби хлористого натрия при 80-100 С при перемешивании.го растворителя, например метанолаили этанола. Полученньп таким образом осадок собирают фильтрованиемили центрифугированием с последующейлиофилизацией с получением веществаК 5, Это вещество К 5 растворяют в воде,добавляют в приготовленный растворравный объем насыщенного, водой фенола, и конечную смесь подвергают интенсивному встряхиванию в холодных ус- Оловиях, в результате чего получаютводныЙ слойе В этот дныЙ слой добавляют насыщенный водой фенол, и затем цикл встряхивания и центрифугирования повторяют дважды. Полученные 5таким образом водные слои объединяют и затем добавляют в них диэтиловый эфир. Конечную смесь подвергаютвстряхиванию и собирают водный слой.Остаточный серный эфир из водного 20слоя удаляют барботированием черезнего газообразного азота. В полученный таким образом водный слой добав.ляют четыре объема чистого этанола.Полученный в результате этого осадок 25растворяют в буфере 0,01 М трис-соляная кислота (рН 6,95), а конечньпраствор заливают в целлюлозную колонну, которую предварительно активируют и обрабатывают указанным буфером. 50Этим же буфером осуществляют элюирование из колонны. Фракции, которыесодержат вещество К 5-2-А, собираюти после диализа и пиофилизации в виде белого аморфного порошка получаютвещество К 5-2-А.Вещество К 5-2-А обладает следующими физико-химическими свойствами.Элементарный анализ, Е: С 39,5;Н 6 5; Й,1.Зольность: следы (0,42).Молекулярный вес: 9000+3000 (путем ультрафильтрования); 7000-9000(центрифугированием по градиенту равновесной плотности); 80003000 (согласно методу поляризации й)люоресцена),Внешний вид - белый аморфный порошок.Температура разложения 185 С50(данные основаны на измерении температуры побурения в соответствии скапиллярным методом с применением силиконового масла МГ-ЗО),УФ-спектрограмма. Отсутствуют какие-либо конкретные полосы максиму 55мов поглощения.рН водного раствора этого вещества составляет 7,25. Р Растворимость. Вещество растворимо в воде, нерастворимо в этаноле, ацетоне, н-гексане, н-бутаноле, феноле и других органических растворителях.Удельное вращение плоскости поляризации света2%Гс)д +67,5+2,оев воде), С+0,во 2 Ч Гомогенность. Центрифугирование вещества КЯ-А осуществляют с линейным градиентом 5-20 Е хлористого цезия в буфере 0,1 М трис-соляная кислота ИРН 7,2) при скорости вращения 38000 об/мин и температуре 4 С в те-. чение 15 ч. Предлагаемое вещество явяется гомогенным. Сравнительные экс перименты по седиментации с вирусными нуклеиновыми кислотами показывают, что предлагаемое вещество не включает в себя вирусных частиц, РНК или ДНК. Электрофорез осуществляют. на ,ацетате целлюлозы с использованием буфера 0,1 И уксусная кислота-пиридин (рН 3, 5). Для сравнения используют хондроитин. По истечении 30 мин электрофореза при токе 0,6 мА/см и напряжении 160 В хондроитинсульфат двигается в направлении катода, проявляя подвижность, равную 4 см/30 мин, тогда как вещество К 5-2-А двигается в направлении анода с небольшой скорос" тью в течение 90 мин (подвижностьсм в 90 мин). Данное вещество явля-. ется электрофоретически гомогенным. Кроме того, электрофорез, осуществленный в тех же самых условиях, что и указанные, за исключением того, что в данном случае в качестве буфера используют систему 1 М пиридин-уксусная кислота (рН 7,0), подтверждает, что данное вещество является гомогенным.Цветная реакция:Фенольно-сернокислотная реакция ПоложительнаяАнтроновая реакция ПоложительнаяРеакция Молиша ПоложительнаяРеакция Элсон-Моргена ОтрицательнаяКарбазол-сернокислотная реакция Положительная.Реакция с реагентом Фолина"Сьокарто ПоложительнаяБиуретовая реакция ПоложительнаяРеакция с ФИТЦ( флуоросцеинизотиоцианат ) ПоложительнаяОкрашивание толуидиновым голубым О Отрицательная8970Нингидриновая реакция ПоложительнаяСахарный составВещество КЬ-А подвергают кислотному гидролизу с последующим аль- % дитолированием и затем ацетилированием, после чего газохроматографическим путем определяют сахарный состав, Это вещество состоит в основном из маннозы у содержит небольшое коли чество глюкозы и галактиозы, а также незначительные количества арабинозы и ксилозы, причем весовое содержание этих компонентов соответственно 74:12:12:1:1, 5Аминокислотный состав.1 О мг вещества К 5-2-А помещают в вакуумную камеру совместно с добавленными к нему 3 мл 6 н, соляной кислоты, после чего его подвергают кис лотному гидролизу при 110 С в тече ние 22 ч. Затем в роторном испарите-, ле удаляют соляную кислоту и с помощью автоматического аминокислотного анализатора осуществляют анализ 23 на аминокислоты.К содержащимся аминокислотам в основном относятся треонин, серии, глутаминовая кислота, алании и аммиак, Кроме того, в небольших коли- рб чествах содержатся аспарагиновая кислота, пролин, глицин, валин и лизин, В виде следов или в ничтожно малых количествах содержатся метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, аргинин и цистин.Вещество К 5-2-А не оказывает непосредственного цитотоксического эффекта на клетки опухоли, При введении вещества К 5-2-А в тело живого организма оно улучшает защитную функцию организма и косвенно ослабляет рост опухолевых клеток, что в дальнейшем приводит к ликвидации этих опухолевых клеток, Кроме того, вещество К 5-2-А не проявляет никакого бактерицидного или противовирусного действия. Однако в том случае, когда это вещество К 5-2-А вводят в живой организм, оно улучшает защитную функцию организма и, следовательно, косвенно ингибирует рост бактерий и вирусов в живом организме, Вещество К 5-2-А способно эффективно излечивать людей и животных от многих инфекционИ ных заболеваний, в частности от вирусного катара верхних дыхательных путей, гриппа, герпеса, коровьей оспы, энцефаломиокардита, инфекционных 99 агепатитов, бешенства, а также заболеваний, вызванных микроорганизмами.Рзецдоеопаз, Сапд 1 са, Е 1 зсег 1 а, ЬгарЬу 1 ососсцз, 5 герососсцз,. 01 р 1 ососсцз, Ме 1 ззег 1 а, Езсйег 1 сЬ 1 а со 11,И 1 соЬассег 1 цш СцЬегсц 1 оз 1 з, 561 го- .сЬаеа 1 ез и Ргоозоа.П р и м е р 1. МикроорганизмОаеда 1 еа д 1 с 1 пз 11 КРОО 6 (ГЕКИ-РМ 0.3994) культивируют в О л среды,которая содержит барду, в аэробныхусловиях1,8 об./об./мин ) при 24 Св течение 11 дней, Затем питательнуюсреду подвергают центрифугированию,в результате чего получают 38 г мицелия, Полученный таким образом мицелий смешивают с 10 л горячего5 Е-ного раствора хлористого натрия икипятят в течение 60 мин с последую-щим отделением верхнего слоя и осадка. Затем выделенный таким образомверхний слой смешивают с этиловымспиртом в таком соотношении, что конечная концентрация этилового спиртасоставляет 707, и оставляют стоятьв течение ночи в холодной темной комнате, Выпавший осадок собирают и лиофилизируют с получением 4 г веществаК 5.Это вещество К 5 обладает следующдми физико-химическими свойствами,Элементарный анализ 1 с помощьюС-Н-М-метра), Е: С 18,62,3 Е;Н 2,8+0,4; М 1,Зф 0,2,Зольность - 10,5 1,ЗЖ.Молекулярный вес (определяют с помощью колонки с биогелем ряда Р иАмикон-ультра-фильтрования) приблизительно 70000,Температура разложения 300 С иливыше.Растворимо в воде, нерастворимов этаноле, н-бутаноле, ацетоне игексане.Цветная реакция (с использованием1 Х-ного водного раствора веществаК 5):Антроновая реакция ПоложительнаяРеакция Морган-Элссна ОтрицательнаяКарбазол-сернокислотная реакция ПоложительнаярН водного раствора вещества К 5находится в интервале от 6 до 7.Внешний вид: белый аморфный порошок.Аминокислотный состав ( на 00 г),г: аргинии 0,4+0,05; лизин 0,5+0,06;гистилин 0,4 ф 0,05; фенилаланин 0,2 -+0,03; тирозин О,ф 0,03;лейцин 0,3+0,041 изолейцин 0,3 ф 0,04 р метионин 0,10,01; валин 0,4+0,05; алании 0,640,08; глицин О,."0,1; пролин 0,6-0,8; глутаминовая кислота 1,2 . ф 0,2; серии 14.0,1; треонин 0,8.0,1; асапарагиновая кислота 14 О,1; триптофан 0,06+0,01; цистин, 0,30,04.Сахарный состав (определяют газохроматограггическим путем), 7.: глюкоза 574 б; галактоза 5 ф 0,5, манноза 26 ф 3; ксилоза 8+0,8, арабиноза 50,3.П р и м е р 2. Вещество К 5, полученное в ходе проведения процесса примера 1, растворяют в воде и в этот раствор добавляют равный объем насыщенного водой фенола. Затем эту смесь подвергают встряхиванию на холоду, после чего подвергают центрифугированию с получением водного слоя. В этот водный слой добавляют водонасыщенный фенол и затем встряхивание и разделение центрифугирбванием повторяют дважды, Полученные таким образом водные слои объединяют друг с другомс последуюцим добавлением этилового эфира. Полученную массу подвергают встряхиванию, а затем собирают водный слои. Остаточный диэтиловый эфир иэ воды удаляют барбатироваиием че- З 0 рез нее газообразного азота. В полученный водньвг слой добавляют четыре объема чистого этанола. После этогосмесь оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате. Полу- Зз ченный таким образом осадок растворяют в буфере 0,01 М трис-соляная кислотарН 6,95 ), а приготовленный раствор заливают в -колонку с целлюлозой Эктеола, которую предваритель но активируют и обрабатывают буфером. Затем элюирование продукта из колонки осуществляют тем же самым буфером, Фракции, которые характеризуют содержание К 5-2-А, собирают и после диализа и лиофилизации получают 0,7 г вещества К 5-2-А. П р и м е р 3Микроорганизм .епС 1 пцз еоосез К 5. Е 28 (ЕЕКМ-Р30 И 0.4196) подвергают культивированию путем встряхивания в среде, котораяосодержит барду, при 24 С в течение 14 дней, после чего конечную питательную среду выливают в О л среды,55 приготовленной разбавлением барды до удельного веса 1,012-1,020, с после-, дующим культивированием в ней при 24 С в аэробных условиях 1 1,8 об.//об/мин ) н течение 11 дней. Затем конечную питательную среду подвергают центрифугированию, в результате чего получают 38 г мицелия. Полученный таким образом мицелий смешивают с 10 л горячего 5 Е-ного раствора хлористого натрия и кипятят в течение 60 мин с последующим отделением верхнего слоя и выпавшего осадка. Полученный таким образом верхний слой смешивают с этиловым спиртом в таком соотношении, что конечная концентрация этилового спирта 703, и оставляют стоять в течение ночи в холодной темной комнате, Таким образом, получают осадок, вещества К 5. Полученное по изложенному вещество К 5 растворяют э воде и в приготовленный раствор добавляют равный объем водонасыщенного фенола, Конечную массу подвергают встряхиванию в холодных условиях, после чего .подвергают центрифугированию с получением водного слоя. В этот водный слой добавляют насыщенного водой фенола и дважды повторяют операции встряхивания и разделения центрифугированием. Полученные таким путем водные слои объединяют друг с другом, а затем добавляют в них диэтилового эфира. Полученную конечную массу подвергают встряхиванию и собирают водный слой, Остаточный диэтиловый эфир из водного слоя удаляют барботированием через него газообразного азота. В конечный водный слой добавляют четыре объема чистого этанола. Конечную (чассу оставляют стоять в течение ночи 1 в холодной темной комнате. Полученный таким образом осадок растворяют в буфере 0,01 И трис-соляная кислота (рН 6,95), а конечный раствор заливают в колонку с целлюлозой Эктеола, которую предварительно активируют и обрабатывают указанным буфером. Элюирование продукта из колонки осуществляют этим же буфером. Фракции, которые характеризуются содержанием вещества К 5-2-А, собирают, подвергают диализу и лиофилизируют. Таким образом получают 0,7 г вещества К 5-2-А.П р и м е р 3 (экспериментальный). Асцитные опухолевые клетки саркомы 180 отбирают с помощью шприца и разбавляют в 10 раз физиологическим раствором поваренной соли. Затем приготовленную таким образэм суспензиювнутримышечно вводят в левое бедро мышам 40 00 (,Я) в количестве по0,1 мл (10+ клеток на каждую О, мл)897099 Доза, мг/кг ПоказательэфФективнос Срединвес Вес опухолевых частей,г мерт- ость,опухолевыхчастей ти 100 50 0,09 0,21 1,0; 0,3; 0)2; 0,15,а у других четырехмышей имелись только следы опухолей 0,02 25 0,05 0,05; 0,4, у остальных 6 мышей имелись 10 только следы опухолей 0 0 У всех 8 мышей имелись только следыопухолей 1,01 2,20 Зь 41 261 4 е 8; 6 ф 8у остальных 4 мышейимелись следы опухолей 0,1 2,7 100 00 1,8; 3,0; 0,7 ь 3,4 1181 2 фЗ 2 вО 2 э 5 Показатель эффективности - средний вес опухолевыхчастей у мышей той группы, которым давали лекарственноесредство/средний вес опухолевых частей у мышей контрольнойгруппы. На каждую особь. По истечении 24 чвещество К 5-2-А, полученное в ходепроведения эксперимента примера 3,растворяют в физиологическом раствореповаренной соли и перорально вводятв виде 12 порций через каждые 24 чв организм мышей четырех групп, каждая из которых включает по 8 особей,причем каждой мьпчи карый раз даютв зависимости от группы соответственно по 100, 1 О, 1 или 0,1 мг/кг. Иышам Контрольнаягруппа( Физиологический раствор поваренной соли) Аналогично приведенные результаты достигаются также в случае использования вещества К 5.П р и м е р 4 (экспериментальный). По истечении 24 ч после единовременного введения внутрибрюшинно контрольной группы дают пероральнотолько физиологический раствор поваренной соли в тех же соответственнопорциях и таким же точно путем, Поистечении 7 недель после введения первых порций вещества К 5-2-А умерщвляют индивидуальных мышей и определяютвес удаленных опухолевых частей. Полученные при этом результаты сведены в табл, 1.Таблица 1 или.перорально мьппам по 200 мк/кг вещества К 5-2-А каждой мили интраперитонеально вводят по 1 О опухолевыхасцитных клеток Эрлиха. После этогоотмечают число дней, в течение которых выживают юппи. В ходе проведения11 897099эксперимента используют весом по 20 ги в возрасте приблизительно 6 недель,12 Таблица 2 сло вывших животных от общег количест 23, 27, 28, 29, 29, 3000, 100, 100, 100 ыше 56,6 4/ итраперитоеальный ыш Через 26, 26, 27, 2 30, свыше 100 22, 23, 24, 2 25 26 26 2 28, 30,100, 100 25, 25,Свыше 49,4 10 О/1 О 2,7 0 ьныйментогичес экспе ,физи кий р створ ов но оли)25 ицаЧисл Среднеечисло дней выживания ыж чение ших ж тны т обегоисла Вещество ККБ-А в дзировке10 мг/мл 25, 26, 3 О/5 То же,2 мг/мл 5 27,6 Аналогичные результаты достигаются ;с использованием вещества К 5.П р и м е р 5 (экспериментальный асцитные опухолевые клетки Эрлиха, взятые у мыши, несколько раз промывают средой ВРМ 1-1640, не содержащей сыворотки, в течение 5 мин при скорости вращения 1800 об/мин, после чего концентрацию клеток доводят до уб 1 х 10 клеток/мл с использованием той же самой среды. Одновременно с этим вещество К 5-2-А растворяют в той же самой среде с получением растворов концентрации 10, 2 мг/мл и 400 мкг/мл и 1 мл каждого из приготовленных таким образом растворов вещества К 5-2-А добавляют в 1 мл указанной суспензии клеток Эрлиха и затем подвергают культивированию в уг- о лекислотном инкубаторе в течение 2 ч при 37 С. В процессе такого культивирования пробирку несколько раз встряхивают. После этого каждую кульПолученные результаты сведены втабл, 2,туру подвергают центрифугировапию пр екорости вращения 1800 об/мин в течение 5 мин с последующей промывкой средой КРИ 1-1640, Полученные таким образом таблетки клеточной массы сус пендируют в 2 мл указанной среды. По 0,2 мл каждой из приготовленных таким образом суспензий интраперитонеально вводят мышам ОО 1 в возрасте 6 недель по 5 особей в каждой группе При этом отмечают число дней, в течение которых выживают животные,Полученные результаты сведены вб 3 Число дней выживания животных виндивидуальных группах оказываетсяпрактически идентичным числу дней,в течение которых выживают животныеконтрольной группы; это указываетна то, что вещество К 5-2-А не оказывает никакого непосредственного цитотоксического действия на раковыеклетки.,Табл 314 897099 3 Продолжение табл, 3 Среднеечисло днейвыживания Числоособеймышей Число дней, в течениекоторых выжили животные Число выживших Лечение животныхот общегочисла То ие, в дозе400 мкг/мл 5 О/5 25, 25, 25, 30, 30 27,0 ВРИ(контрольныйэксперимент) 5 24, 25, 26, 28, 32 О/5 27,0 Лечений мышей, имеющих опухоЧисло Число дней, в течение особей которых животным удамьппей лось выжить Среднеечисло днейвыживания Число выжив ли шихособейот общегочисла Свьппе 70,0 5/10 Макрофаг мышей,Овылеченных веществом К 5-2-А 26, 40, 43, 45, 46, свыше 100, 100, 100, 100, 100 О/О Макрофаг мыши, 1 О которую не подвергалн лече- нию 24, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 34, 35 29,6.О/10 Только среда 10фРИ 1+1640 26, 26, 27, 28, 28 28, 29, 29, 30, 31 28,2 П р и м е р 6. (экспериментальный). Мьппам 001 (с весом тела 20 г и в возрасте 6 недель) интраперитонеально вводят по 200 мг/кг вещества К 5-2-А и по истечении 24 г средней КРИ 1-1640, не содержащей сыворотки, вымывают перитонеальные эксудативные клетки. Затем вымытые эксудативные клетки подвергают культивированию в углекислотном инкубаторе в течение 2 ч, После этого не обладавшие адгезионной способностью клетки направляют в отход, а обладавшие адгезионной способностью клетки дважды или трижды промывают средой ВРИ, подогретой до 37С. Эти клетки, которые прочно прилипают к чашке Петри, собирают с использованием трипсина и35 ЭДТК, в результате чего получают макрофаг, вьделенньш из организма мышей, вылеченных веществом К-А. Одновременно с этим других мышей ООв возрасте 6 недель заражают асцитными опухолевыми клетками Эрлиха путеминтраперитонеального введения в организм каждой особи по О клеток.Интраперитонеально в организм этихмышей вводят упомянутый макрофаг эа24 ч до их заражения опухолевыми клетками, а затем им вводят в общей сложности 10 раз через интервалы в 3 дня:каждьп раз от 5 х О до 1 х 10клеток. При этом отмечают число дней,в течение которых животным удалосьвыжить. Полученные результаты сведеныв табл. 4Таблиц а 415 8970П р и м е р 7 ( экспериментальный). Трансформированный акклиматизированный клеточный материал РМ - ЗА, приготовленньп с концентрацией 1 х 10 клеток/мл с использованием среды МЕМИгла, в которую добавляют 107 плодной сыворотки теленка (ПСТ), загружают в 3 различных склянки для культивирования а, в,и с. В склянке а культивирование проводят без какого-либо 10 добавления в нее макрофага. Процесс культивирования в склянке 4 проводят в присутствии 1 х 10 клеток/мл неактивированного макрофага, полученного в процессе экспериментального при мера 6, Процесс культивирования в склянке с проводят в присутствии 1 х 10 клеток/мл макрофага, полученного от мышии, которую лечат веществом К 5-2-А, в соответствии с изложен ным в экспериментальном примере 6. Процесс культивирования проводят при 37 0 С в атмосфере 5 Ж углекислого газа в течение 72 ч. По истечении 24, 48 и 72 ч с помощью камеры для подсчета кровяных телец определяют число клеток ГМ-ЗА. Макрофаг, активированный веществом К 5-2-А, оказывает ингибирующее действие на рост раковых клеток, 30П р и м е р 8 (экспериментальный). 40 мышам РР среднего веса 22 г интраперитонеально вводят по 200 мг/кг вещества К 5-2-А (группа 1). В организм других 40 мышей ОР через рот вводят по 500 мг/кг вещества К 5-2-Л (группа 2).По истечении 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 и 32 ч из каждой группы мышей отбирают по 5 особей и умерщвляют с 40 последующим взятием крови. Полученную таким образом кровь подвергают центрифугированию со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 мин с получением сыворотки. Титр интер ферона измеряют в клетке мыши штамма 1.-10 без тимидинкиназы и везикулярного стоматичного вируса (ВСВ). Титр интерферона получают посредством определенного эффекта цитофатитной вирусной защиты (ЦВЗ), который достигается посредством разбавленной сыворотки крови. Укаэанный титр интерферо 99 6на откалиброван относительно международной интерфероновой единицы.П р и м е р 9 (экспериментальный),В организм мышей РО четырех групп (среднего веса 20 г и в возрасте примерно б недель) интраперитонеально вводят по 200, 100, 50 и 25 мг/кг вещества К 5-2 - А. По истечении 24 ч после введения этого вещества у мьпдейкаждой группы берут кровь для определения титра циркулирующего интерферона,Полученные результаты приведеныниже.Интраперитонеальное Титр интерферовведение вещества на/млК 5-2-А в дозировке,мг/кг200 800100 80050 80025 80Эти образцы интерферона проявляюттакие общие свойства интерферона, какчувствительность к трипсину, специфичность видов паразитов в отношениихозяина.П р и м е р 1 О (экспериментальный). Микроорганизм .1 зСега щопосуСо 9 епез 1 з, выделенный из организма пациента, который был заражен листериозом, суспендируют в дистиллированной воде с концентрацией 10 виру 8 сов/мл, после чего эту суспензию используют для заражения инъекций в хвостовую вену мышей из расчета по 0,1 мл/особь. За 24 ч до заражения листериозом в организм мышей интраперитонеально вводят по 0,5 мл раствора вещества К 5-2-А, В различных группах мышей дозировка вещества К 5-2-А составляет при этом от 5 до 425 мг/кг на каждую индивидуальную особь. В организм мышей контрольной группы интраперитонеально вводят по 0,5 мл физиологического раствора соли. После этого отмечают количество мышей, которые выживаю; в течение 20 дней после их заражения, а затем определяют выживаемость в процентах.Полученные таким образом результаты сведены в табл. 5.17 897099 епен Число осоДоза веществаК 5-2-А при интраперитонеальновведении в организм, мк/кг ыживае" сти жи тных, 7. пользован опыт ажения 8 87,0 контрольныи ксперимент) 11экспер проведени уществляют писанное в ре 1 О, за том случае 5 до исло/к мер особен, ко0 дней посл ени лечение, что и ментальном при аСсчи в пр нм обем т К 5-2 организм иышей ч блиц Степен Доза вещества, Числ К 5-2-А при введе вотны нии в организм ыжи емости животных, Х рез рот,мг/к 425 10 87,5 10 87,0(контрольный эксперимент) альныи). В х ксперимента менданного то же самое экспериисключенивещество18 Таблица 5 Число особей, которые выжилив течение20 днейпосле их рот в дозировке оПри этом отмечаюторые выжили в тих заражения, иваемость животныПолученные так сведены в табл. Число особей, выживших в течение 20 днейпосле заражения зом результа

Смотреть

Заявка

2596656, 29.03.1978

Заявитель Кирин Сиграм Лимитед

НАКАО ИСИДА, ХИРОСИ МАЕДА, ФУДЗИО СУЗУКИ, ТОСИКАЦУ ФУДЗИИ, ИТУРО МИЦУТАНИ

МПК / Метки

МПК: A61K 31/198, A61K 31/70, A61P 31/00, A61P 35/00

Метки: антимикробным, вещества, действием, кs-2-а, обладающего, противоопухолевым

Опубликовано: 07.01.1982

Код ссылки

<a href="https://patents.su/12-897099-sposob-polucheniya-veshhestva-ks-2-a-obladayushhego-protivoopukholevym-i-antimikrobnym-dejjstviem.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения вещества кs-2-а, обладающего противоопухолевым и антимикробным действием</a>

Похожие патенты