Способ количественного определения новокаинамида

СОЮЗ СОНЕ гСкИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1760438(19) 5)5 6 01 й 21/78 18 ( ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ВТОРСКОМУ ДЕТЕЛ ЬСТВ(54) СПОС ДЕЛЕНИЯ (57) Сущно пробу об ром и-ди да в коли присутст цией 4,0 с последу ученного кова шеле фотометрированием полученного окрного соединения (1),Недостатком способа является евысокая чувствительность (2 мгlмл).Известен способ определения нонамида с использованием в качествгента лактата этакридина (2).Недостатком способа являетссложность, связанная с необходимостстракции, а также недостаточно вычувствительность - 27 мг/мл.Наиболее близким к изобретениюется способ определения новокаина ен о неа е я его ью эк- сокая Ям ГОСУДЛРСТВЕННЫЙ КОМИТ ЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский институт химии Саратовского государственного университета им. Н. Г.Черн ышевского и Саратовский медицинский институт (72) Р,К.(ернова, К.И.Бендер, Н.Н,Гуса Г,М,Борисова, С.А,Шевченко и Л.Г,Ко ва(56) Буга И.А., Бабилев Ф,В. Экстракционнофотометрическое определение новокаина и новокаинамида. - Фармация, 1973, с,22, й.4, с,42 - 46.Ивахненко П,Н Чигаренко Л.С., Килякова Г.М. Фотометрическое определение новокаина и новокаинамида. - Фармация, 1977, с.26. М 6, с.55-57.Рыжков (О.Д., Базова Р,П., Пшеничная Д.П. Экстракционно-фотометрический метод определения новокаинамида. Методы аналитического контроля окружающей среды, материалы семинара. М., 1980. с.142 - 144,Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения новокаина- мида, Новокаинамид относится к противоаритмическим средствам (ПАС). Кроме того в эту группу входят хинидин, аймолин, этмозин. Предлагаемый способ позволяет определять новокаинамид в присутствии других ПАС на серийной отечественной аппаратуИзвестен способ определения новокаинамида путем взаимодействия его с бромфеноловым синим с последующим ОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕ-.НОВОКАИНАМИДАсть изобретения; анализируемую абатывают спиртовым раствоетиламинокоричного альлдегиестве 4,5 10 -4,5 10 М в ии сульфонала с концентра з - 4,0 10 М при рН 2,0 - 5,0 ющим фотометрированием поластвора, 11. табл.19 1760438 20 Таблица 11еетеемщщеабазовый объектс трепеолином 00 Показатель Предлагаемый способ Прототип с тропеолином 00Ю СпособПредел обнаружения фотометрический0,04 мкг/мл, .15 си фотометрический11 мкг/мл Титриметрический Диапазон определяемыхсодержаний 0,04-0,4 мкг/мл, 1=5 сн Нет сведений0,2-4,0 мкг/мл, 1=1 см 0,1-0,3 гЛО мл Среда, рН Цитратный буфер;рН 2,0-5,0 рН 3,2-7,0 Разбавленная НС 1 Оелективность Нет сведений 01 мл 0,23-ного раствора и-диметиламинокоричного альдегида "4,5.10 ь -4,51 О ;сульфонол - 40 1 О2,0 10 зН Органический реагент Не используются6-10 ч Экстрагенты хлороформ Устойчивы Не используютсяНет сведений Устойчивость знал,форм 540т,нм 418 Лекарственные формы (ампулы, табйетки)кровь, слюна Объекты анализа Таблетки, иньекционные растворы Ампульные растворы, таблетки Составитель С, ХованскаяТехред М,Моргентал Корректор М. Ткач Редактор А. Кулакова Заказ 3183 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Не мешают определениюдругие антиаритмические средства (см, табл. 7) водно-спиртовый (1:1) раствортропеолинаОО Тррпеолин 00с метиленовььсинимпредела обнаружения новокаинамида ми нимальна при концентрации и-ДМАКА 4,56 Хх 10 5-4,56 10 М концентрацил сульфонола 4 10 - 2,0 10 М, рН 2-4,-зИсследован широкий круг лекарственных препаратов, которые могут быть назна 55 основанный на обработке реагентом тропеолином 00 31,Недостатком способа является необходимость экстракции, что приводит.к сложности способа, а также его невысокаячувствительность (11 мг/мл).Цель изобретения - упрощение способа, повышение чувствительности и селективности определения.Цель достигается тем, что определениеновокаинамида проводят путем обработкипробы спиртовым раствором и-диметиламинокоричного альдегида (и-ДМАКА) в присутствии сульфонола с концентрацией вреакционной смеси 4,0 10 - 4,0 10 г Мпри рН 2,0-5,0 с последующим фотометрированием полученного раствора.Эксперимент показал, что растворы, содержащие новокаинамид и органическийреагент п-ДМАКА, окрашены в желтый цвет,Спектры поглощения двойных систем в среде цитратных буферных растворов с рН1,25 - 6,0 представлены двумя полосами поглощения с Аакс = 265-280 нм и Амакс = 400нм. Введение третьего компонента - раствора сульфонала приводит к возникновению ярко-малиновой окраски растворасистемы.Спектры поглощения тройных системновокаинамид-и-ДМАКА-сульфонол представлены при всех значениях рН тремя полосами поглощения Лмакс= 280 нм ЛиаксИ=370 - 400 нм, Ямакс =570 нм,ЛХ составляет170 нмУстановлены оптимальные условия определения новокаинамида с и-ДМАКА исул ьфонолом,Изучение зависимости светопоглощения систем новокаинамид-п-ДМАКА-сул ьфонол от рН среды показало, чтооптимальной средой являются цитратныебуферные растворы с рН 2,0 - 5,0;2,0 рН 5,0,Исследовано влияние Сдмдкд на правильность. получаемых результатов определения новокаинамида.Как следует из данных, представленныхв табл.1, наименьшие ошибки определенияновокаинамида наблюдаются в интервалеконцентраций 0,1 - 1,0 мл 0,2%-ного раствора и-ДМАКА (4,510 МСп-дмдкд 4,510 М).Установлена оптимальная концентрация сульфонола в реакционной системе.Для этого исследовано и систем, содержащих постоянную концентрацию и-ДМАКА(0,1 мл 0,2 о -ного раствора), рН растворовбыла постоянной, равной 4,0. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Установлено, что концентрация сульфонола в различной смеси должна составлять 4,0 10 С 2,0 10 М, что достигается при добавлении сульфонала в количестве 1 - 5 мл 10 М,Все дальнейшие исследования проводили с растворами следующих концентраций: 0,1 мл 0,2%-ного раствора и-ДМАКА;-г3 мл 10 М сульфонола, Чобщ = 25 мл,Изучена подчинимость системы новокаинамид-п-ДМАКА-сульфонол закону БугераЛамберта-Бера, размах варьирования концентраций составлял 1 - 100 мкг/25 мл. Установлено, что по предлагаемому способу определения новокаинамида можно находить как большие, так и маленькие концентрации противоаритмического средства. Установлено два определяемых диапазона концентраций новокаинамида.(большие количества) 5 - 100 мкг/25 мл, или 0,2 - 4,0 мкг/мл, =1 см(маленькие количества) 1 - 10 мкг/25 мл, или 0,04 - 0,4 мкг/мл, =5 смДоказательство существования диапазона определяемых содержаний новокаина- мида приведено в табл,З.Анализ данных, представленных в табл,З, показал, что ошибки определения соответствуют фотометрическому методу и не превышают 10% в интервале 5,0 - 100,0 мкг/25 мл при= 1 см, 1,0- 10,0 мкг/25 мл при= 5 см.Нижняя граница диапазона определяемых содержаний новокаинамида - 1 мкг/15 мл, или 0,04 мкг/мл - следовательно, это и может быть принято за предел обнаружения.В литературе 1) указано, что предел обнаружения по методу-прототипу составляет 11 мкг/мл, следовательно по предлагаемому способу удалось снизить предел обнаружения в 250 раз,Изучена зависимость предела обнаружения новокаинамида от рН среды и концентрации реагента, а также третьего компонента (табл,4 - 6),Анализ данных, представленных в табл.4 - б, показал, что ошибка определения цены больным совместно с новокаинамидом,Соотношение новокаинамида к мешающему компоненту было выбрано 1:1 согласно прописываемой рецептуре в медучреждениях. Как видно из данных, 1760438плотностью строят зависимость А = 1(С), Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется при концентрации новокаинамида 5 - 100 мкг/25 мл, или 0,2 - 4,0 мкг/мл при= 1 см.П р и м е р 2. Построение градиуровочной характеристики для количественного фотометрического определения малых количеств новокаинамида.Точную навеску субстанции сухого препарата новокаинамида (0,0250 г) помещаютв мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяют в дистиллированной воде. Стандартный раствор содержит 1 мг/мл новокаинамида, рабочий раствор содержит 10 мкг/мл новокаинамида. 455055 представленных в табл,7, препараты изгрупп антиаритмические средства (ч.ч. 2729), противотуберкулезные средства(ГФ 12,19-23); антибиотики (Ке 25 и 26) идругие препараты широкого спектра действия не оказывают мешающего действия нарезультаты определения новокаинамидапредлагаемым способом. Чрезвычайно важно, что возможно определение новокаинамида в присутствии других 10антиаритмических средств.Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.П р и м е р 1. Построение градуировочной характеристики для количественного 15фотометрического определения большихколичеств новокаинамида.Точную навеску субстанции сухого препарата новокаинамида (0,0250 г) помещаютв мерную колбу вместимостью 25.мл и растворя ют в дистиллирован ной воде. Ста ндартный раствор содержит 1 мг/млновокаинамида, рабочий раствор содержит100 мкг/мл новокаинамида. Для построенияградуировочной характеристики в мерные 25колбы вместимостью 25 мл помещают по10 - 15 мл буферного раствора рН 4,0, затем0,1 мл (10 мкг), О,Змл (30 мкг), 0,5 мл (50 мкг),0,7 мл (70 мкг), 1,0 мл (100 мкг) рабочего раствора новокаинамида с С = 100 мкг/мл, прибавляют в каждую колбу 0,1 мл 0,2 -ногораствора и-ДМАКА и 3 мл 10 М растворасульфонола и доводят до метки буфернымраствором рН 4,0,Оптические плотности указанных растворов измеряли на КФК-УХЛ 4,2 в кюветах с толщиной поглощающего слоя = 1 смпри Л= 540 нм относительно холостого раствора, в состав которого входят цитратныйбуферный раствор рН 4,0, 0,1 мл 0,2 -ного 40раствора и-ДМАКА (4,56 10 М) и 3 мл 10М раствора сульфонола (1,2 10 М), Чбщ ==25 мл.По полученным значениям оптической Для построения градуировочной характеристики для малых количеств новокаинамида в колбы на 25 мл вносят по 7 - 10 млбуферного цитратного раствора рН 4,0. затем 0,1 мл (2 мкг), 0,3 мл (3 мкг), 0.5 мл (5 мкг),0,7 мл (7 мкг), 1,0 мл (10 мкг) раствора новокэинамида с концентрацией 10 мкг/мл. Добавляют по 0,1 мл 0.2 -ного раствораи-ДМАКА и по 3 мл 10 М раствора сульфонола и доводят объем в каждой колбе дометки цитратным буферным раствором рН4,0, Оптические плотности полученных растворов измеряют на КФК-УХЛ 4,2 в кюветах с толщиной поглощающего слоя= 5 смпри 3 г 540 нм. Раствор сравнения готовяткак в примере 1, По полученным даннымоптических плотностей строят зависимостьА = 1(С). Градуировочная характеристикапрямолинейна в интервале концентраций1 - 10 мкг/25 мл, или 0,04 - 0,4 мкг/мл новокаинамида, Предел обнаружения - 0,04мкг/мл новокаинамида.П р и м е р 3. Определение содержанияновокаинамида в таблетках.Анализируемые таблетки лекарственных форм тщательно растирают в фарфоро-вой ступке. Точные навески 0,5000 гколичественно переносят в мерные колбы ирастворяют в дистиллированной воде, Аликвоты полученных .растворов переносят вколбы на 25 мл и далее проводят определение новокаинамида, как в примере 1. Полученные результаты приведены в табл.8,Анализ данных, представленных втабл,8, позволяет заключить, что предлагаемый способ определения новокаинамидаотличается хорошей воспроизводимостью иправильностью.П р и м е р 4. Определение содержанияновокаинамида в донорской крови,При подготовке крови к анализу белкикрови осаждают трихлоруксусной кислотой,В пробирки вносят по 2 мл крови доноров, добавляют 30 мкг новокаинамида, тщательно перемешивают. Время контактапрепарата с кровью варьировали от 1 миндо 20 ч, После фиксированного времени контакта осаждают белки 2 мл 30;4-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь перемешиваютстеклянной палочкой и центрифугируют 5 -10 мин на центрифуге при скорости 3000об/мин. Фильтрат сливают в мерные колбына 25 мл, добавляют к фильтрату 8 - 10 млбуферного раствора рН 4,0, 0 1 мл 2 -ногораствора п-ДМАКА, 3 мл 10 М растворасульфонола и доводят до метки буфернымраствором. Полученные смеси фотометрируют по примеру 1, Содержание новокаинамида определяют по градуировочнойхарактеристике, Результаты определенияновокаинамида в донорской крови приведены в табл.9.Анализ результатов определения новокаинамида в донорской крови позволяет сделать следующие выводы: 5Вне зависимости от групповой принадлежности крови и .ее резус-фактора возможно определение новокаинамида предлагаемым способом.Время контакта новокаинамида может 10 быть достаточно длительным, это не влияет на результаты анализа.По методу "введено-найдено" показано, что результаты отличаются правильностью и хорошей воспроизводимостью, 15П р и м е р 5. Определение содержания новокаинамида в слюне.При подготовке сионы к анализу белки, входящие в ее состав, осаждают 96 Д-ным спиртом-ректификаторам. 20В мерные пробирки собирают слюну испь 1 туемого, центрифугируют в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин (для осаждения твердых остатков слюны). Затем добавляют 2 мл осадителя и центрифугируют еще 25 7-10 мин, Фильтрат переносят количественно в мерные колбы на 25 мл и добавляют к каждому фильтрату по 10 - 12 мл буферного раствора рН 4,0 по 0,1 мл 0,2%-ного раствора и-ДМАКА и по 3 мл 10 У раствора 30 сульфонола. Смеси доводят до метки буфер" ным раствором и фотометрируют как указано в примере 1. Результаты определения новокаинамида у случайно выбранных сотрудников приведены в табл.10. Как следует 35 из представленных данных, ошибка определения новокаинамида не превышает 10;. Определение новокаинамида в слюне является очень перспективным, так как позволяет легко произвести забор анализируемой 40 биологической жидкости, особенно по сравнению с кровью.Существенным отличием нового способа определения новокаинамида является проведение реакции новокаинамид-и-ДМА КА в присутствии сульфонола в среде цитратного буферного раствора рН 2-5, Эти два серьезных изменения привели к тому, что удалось, во-первых, снизить значительно предел обнаружения: в 250 раз по сравне нию с прототипом; во-вторых, изменить селективность реакции. Новый способ позволяет определять новокаинамид в присутствии других антиаритмических средств, что особенно важно, а также в присутствии противотуберкулезных препаратов и антибиотиков широкого спектра действия. В-третьих, расширен диапазон определяемых содержаний новокаинамида (0,04 - 0,4 мкг/мл; = 5 см; 0,2 - 4,0 мкг/мл, = 1 см). Предлагаемый способ впервые позволяет определять малые количества новокаинамида (0,04-4 мкг/мл), Кроме того впервые показана возможность определения новокаинамида в крови и слюне, что чрезвычайно важно для определения наилучшего терапевтического эффекта с учетом индивидуальной чувствительности больного и своевременного поддержания эффективной лечебной концентрации препарата в организме. Данным способом можно определять.и большие количества новокаинамида, что может быть использовано в фармацевтическом контроле. Предлагаемый способ анализа новокаинамида экспрессен, прост, выполняется на серийной отечественной аппаратуре с использованием выпускаемых в СССР органических реагентов и может быть доступен для выполнения в клинических и биохимических лабораториях лечебных учреждений.В табл.11 приведено сравнение предлагаемого способа с прототипом и базовым объектом. формула изобретен ия Способ количественного определения новокаинамида путем обработки анализируемой пробы органическим реагентом в кислой среде с последующим фотометрированием раствора, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, повышения чувствительности и селективности определения, в качестве реагента используют спиртовой раствор и-диметиламинокоричного альдегида в количестве 4,5 10 5 - -4,5 10 М иобработкуведутв присутствии сульфонола с концентрацией в реакционной смеси 4,0 10 -4,0 10 2 М при рН 2,0-5,0.1760438 10 Таблица 1 Определение содержания новокаинамида при различной концентрации и-ДМАКАТабл и Определение содержания новокаинамида при различной концентрации сульфонолааблица становление границ определяемых содерж ( С и-дмдкд = 0,1 мл 0,2 -го ра Ссульф = 3,0 мл 10 М, рН 4,0, Ч ании новокаинамида твора,бщ= 25 мл)1760438Таблица 4Зависимость значения предела обнаружения от концентрациии-ДМАКА ( рН 4,0, Ссульф = 3 мл 10 М, Чобщ = 25 мл. 1= 5 см)Таблица 5Зависимость значения предела обнаружения новокаинамида от концентрации сульфонола(С-дмдкд 4,5610 М(0,1 мл 0,2 -ный раствор), Чобщ=25 мл, 3=5 см) Таблица 6Зависимость значения предела обнаружения новокаинамида от рН среды14 1760438 Таблица 7Нсследование влияния неяапцих компонентов на результатыопределения новокаинанмда с и-ЛНКЛ и с 1 льфонопом (РН 4,0,С апяяд4,561 ОЗН, Стртмя, е 1,21 О Н, Сцю 1 ЬСН.у20 икг, Кфц,3540 нн Ноаоканнанид, мкг Лснреюность,ЭеТеее Химическое название взятонайденоее ее1 Эуфилпнн Теофиплии+1,2-зтилен,0 22,0днаинн 1 О,О 9,6 21,92 6,4 16,32 3 Атропнна сульфат Тропнмовый зфнр 1(,2- 20,0троповой кислоты 3 з-Лннвтилацинозтипоео,0 го эфира бензогидропа ГИДРОХЛОРИП Дкиедрол 21,46 7.З 5 Днбазол6 дооперидол В, 7,6 21,62 18,46 2-бензнлбензамидазол 20,0 20 О 7 Оксмбутират8 Глюкоза 18,16 9,2 6,4 1,3 Глюкоза 20,0 10 Окснтоцин 20,0 21,80 20,0 9,0 11 Но-Фпа г 1,04 Тиланмд с(,"зтилмзони,0котиновой кислоты 12 Этионанид 21,26 18152 6,3 7,4 Ночеенна 20,0 Д " " анино+нет О О тионасляная кислота 13 Ночевина 14 Нетионнн 18,26 8,6 2 Аннноглутаровая 20,0кислота 15 Кислота глутаяминовав 4,1 20,96 Г 16 21,74 6,7 Аниноуксусняя кислота 20,0 Кислота аннноук.сусная ЛАнино 4-(3-индо,0лил)пропионпвая кмспзта 9,6 1 Э Л-Трнптсфан 21,92 20,0 16,48 7,6 Гндразид никотиновойкислоты Изонназид (тубазмд) 7,6 21,52 20,0 3-Нетокси-оксибензилиденгцдразнл изоннкотмноаой кислоты 20 Фтмеазид 5,4 21,04 20,0 2.Карбокси-з,о-дине"тонснбснзяльизоннкотинонпгидразом 21 Салюзид 20,0 21,60 9,0 1,1-Нвтилснбис-(изонмкотиномпгидразон) 22 Нетазид 6,6 16,64 20,0 Гмдразид цняиуксуснойкислоты 23 Циезид24 Амималон 6,2 18,36 ь(-Анинонасляная кислота 20,0 6,7 го,о21,34 Аниноглюхознд кана- ницин 25 Каманнцинесульфат 16,0 10,0 20,0 26 Нееацин 6,5 11,70 20,0 Кордафен (Фенигидин 1 нифедитнн) г 7 1,4 21,66 Иидольное промзвпдное 20,0Вйма 1 ии Айнамм (аритнам, кардиоритмнн, ритмов) 26 7,2 20,0 16,56 29 Этнозим ГГ ( Неюаюцнй компонентпl лФармакологическоеназвание 2 Напааерина хпо- Гндрохлорцд 6,7-динет,0 рида лксм-(3 Н.дицетокси" бвнзол).изохннолина1,3-(и-фторбензол)- пропил-(2-оксо.бензинидазолинил)- 1,2,5,6-тетрагилропирипинНатрневая соль )-ок,0 сниасляной кислоты 9 Хлористый калиЯ Калий хлористый 20,0 йептндный горнон задмей доли гипсфиза1.(3,4"Лнзтоксибензнлиден)-6,7-дизтокси,2,3,4-тетрагндроизохииогина гидрохлорид Кислота анныокап .анинокапроноеая 20,0ромовая кислота Аннноглюкозид неомицин2,5-Лицвтнл-(2-ннтРофенил)-1,4.дигидроепиридни,5-днкаобоноеой кислоты динетнло ый зфнр Этиловый зфир 2"каро аннновой кисгюты 1 О фарфолилпропнпю 1 п)Фенотиазмна гипрохпо- рид 21,34 1 Э, 72 21,6616 1760438 Таблица 8 Определение содержания новокэинамида в таблетках "Новокаинамид"1760438 18 Таблица 10 Результаты определения новокаинамида в слюне (всем участникам эксперимента введено по 30,0 мкг препарата)