Способ получения гетерогенных биокатализаторов
Формула | Описание | Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Формула
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ, включающий эмульгирование водного раствора фермента в растворе пленкообразующего полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе, образование в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, формование пленки и волокна, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности иммобилизации и ферментативной активности иммобилизованного фермента, в раствор фермента или в водную фазу эмульсии вводят полифункциональный сшивающий агент, и образование пространственно-структурированного полимера проводят сшивкой фермента в растворе полимера.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в водный раствор фермента вводят водорастворимый полимер.
Описание
Наиболее близким к способу, описанному в предлагаемом изобретении, является способ, заключающийся в том, что фермент включают в структуру полимерного материала формованием из прядильного раствора, полученного эмульгированием водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом раcтворителе c поcледующим образованием в водной фазе эмульcии пространственно-структуpированного полимера, включающего фермент, и превращение эмульсии в суспензию. Для этого в водный раствор фермента перед эмульгированием вводят по крайней мере один водорастворимый мономер, способный образовывать пространственно-структурированный полимер, и компонент инициирующей полимеризацию системы, затем после образования эмульсии добавляют второй компонент инициирующей полимеризацию системы, а после полимеризации мономеров в водной фазе превращения эмульсии в суспензию формуют полимерный материал.
При иммобилизации по этому методу ферментов с мол.м. менее 100 тыс. в водный раствор фермента дополнительно к мономеру и компоненту инициирующей полимеризацию системы вводят полифункциональный сшивающий реагент, способный реагировать с функциональными группами макромолекулы фермента и пространственно-структурированного полимера.
Полифункциональный сшивающий реагент может быть введен в готовую эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера и несмешивающемся с водой органическом растворителе.
В прядильном растворе, содержащем набухший в воде пространственно-структурированный полимер, включающий фермент, невозможен переход эмульсии типа "вода в масле" в эмульсию типа "масло в воде". Благодаря этому становится возможным повышение концентрации волокно- или пленкообразующего полимера в прядильном растворе как путем отгонки из раствора части органического растворителя, так и путем смешения его с более концентрированным раствором полимера. Возможно также формование полимерного материала непосредственно из полученного прядильного раствора.
В способе-прототипе волокна формуют по сухому или мокрому способу, а пленки по сухому способу.
Указанный способ-прототип позволяет получать гетерогенные биокатализаторы, содержащие необратимо связанные ферменты. Эффективность иммобилизации ферментов при этом способе составляет для уреазы 23,7% (при активности иммобилизованной уреазы 9 тыс. ед/г), для пенициллинамидазы от 19,2 до 56% (при активности иммобилизованной пенициллинамидазы до 30 тыс. ед/г), для трипсина 14%
Недостатком указанного способа получения гетерогенных биокатализаторов, содержащих необратимо связанные ферменты, является сложность процесса. Эта сложность заключается в том, что в водный раствор фермента и в эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе приходится вводить много реагентов, необходимых для получения включающего фермент пространственно-структурированного полимера (мономер или смесь мономеров, два компонента инициирующей полимеризацию системы, полифункциональный сшивающий реагент), а процесс является многостадийным. Учитывая, что ферменты являются крайне лабильными веществами, необходимость использования большого числа реагентов и многостадийность процесса существенно затрудняет процесс получения гетерогенного биокатализатора высокого качества.
Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности иммобилизации и ферментативной активности иммобилизованного фермента при уменьшении числа реагентов, необходимых для образования пространственно-структурированного полимера, включающего фермент.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения гетерогенных катализаторов, включающем эмульгирование водного раствора фермента в растворе пленкообразующего полимера и несмешивающемся с водой органическом растворителе, образование в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, и формование пленки и волокна, в раствор фермента или в водную фазу эмульсии вводят полифункциональный сшивающий агент, и образование пространственно-структурированного полимера проводят сшивкой фермента в растворе полимера.
В водный раствор фермента может быть введен водорастворимый полимер.
Полимерный материал формуют непосредственно из полученного прядильного раствора или увеличивают в нем концентрацию волокно- или пленкообразующего полимера путем отгонки из раствора части органического растворителя, смешения его с более концентрированными раствором полимера или растворения дополнительного количества полимера.
П р и м е р 1. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере, рН7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержащие белка 160 мг/мл) и эмульгируют в течение 20 мин при 20оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мг 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из указанного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и хранят в 0,066М фосфатном буфере (рН7,5, 4оС). Ферментативная активность (за 1 единицу активности пенициллинамидазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль 6-аминопенициллановой кислоты при гидролизе 0,016М раствора бензилпенициллина в 0,066М фосфатном буфере, рН 7,5 при 41

П р и м е р 2. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 250 мл метиленхлорида добавляют 40 мл охлажденного до 0оС раствора пенициллинацилазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл) и эмульгируют при перемешивании мешалкой (700 об/мин) в течение 20 мин при 20оС. К полученной эмульсии приливают 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из полученной суспензии ферментного препарата в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде путем продувания воздуха над перемешивающейся суспензией отгоняют часть метиленхлорида до концентрации триацетата целлюлозы в растворе 6% Из полученного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер. Ферментативная активность полученного препарата и эффективность иммобилизации равны соответственно 39000 ед/г сухой пленки и 45,0%
П р и м е р 3 (сравнительный по прототипу). Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют охлажденный до 0оС раствор, представляющий собой смесь: 40 мл раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5% (ферментативная активность 21500, содержание белка 82 мг/мл), 4 мл раствора в воде смеси акриламида и метилендиакриламида (весовое соотношение мономеров 9: 1, концентрация в растворе 500 мг/мл), 2 мл 25% водного раствора персульфата аммония и проводят эмульгирование при 20оС в течение 20 мин при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин. Затем добавляют 1,0 мл N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина и перемешивают 10 мин при 20оС (50 об/мин). В результате полимеризации акриламила и метилендиакриламида в водной фазе происходит образование полиакриламидного геля, в структуру которого были включены макромолекулы пенициллинамидазы. К полученной суспензии ферментного препарата в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде добавляют 6 г триацетата целлюлозы и растворяют 2 ч при 20оС. Из указанного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4оС). Ферментативная активность полученного препарата 11640 ед/г сухой пленки, эффективность иммобилизации 22,5%
П р и м е р 4. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида добавляют 40 мл охлажденного до 0оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 21500 ед/мл, содержание белка 82 мг/мл) и эмульгируют при 20оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 12 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют 15 мин при 20оС. Затем в полученную эмульсию вводят концентрированный раствор 6 г триацетата целлюлозы в метиленхлориде и перемешивают в течение одного часа при 20оС. Из указанного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и хранят в 0,066М фосфатном буфере (рН 7,5, 4оС). Ферментативная активность полученного препарата равна 12060 ед/г сухой пленки и эффективность иммобилизации 22,6% Таким образом, при том же, что и в сравнительном примере 3, способе приготовления прядильного раствора активность полученного гетерогенного биокатализатора и эффективность иммобилизации близки к соответствующим характеристикам катализатора, полученного в примере 4 прототипа.
П р и м е р 5. К раствору 10 г полиарилата Ф-1 в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5, ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл, и эмульгируют в течение 20 мин при 20оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из указанного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4оС). Ферментативная активность полученной пленки 60000 ед/г сухой пленки и эффективность иммобилизации 57,9%
П р и м е р 6. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 40 г триацетата целлюлозы в 320 мл метиленхлорида добавляют 60 мл раствора уреазы в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0; содержание белка 81,5 мг/мл, ферментативная активность 47700 ед/мл (за одну единицу активности уреазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль аммиачного азота при гидролизе 2% раствора мочевины в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0) и эмульгируют 20 мин при механическом перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 1,5 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин при 700 об/мин. Полученный раствор выдерживают при 20оС в течение 1 ч и используют для формования волокна по мокрому способу в осадительную ванну толуол метиленхлорид 89 11 (объемные). Полученное волокно сушат от органических растворителей 2 ч на воздухе и хранят под 0,1М фосфатным буфером рН 7,0 при 4оС. Ферментативная активность полученного препарата 31400 ед/г сухого волокна, эффективность иммобилизации 53%
П р и м е р 7. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 2 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида добавляют смесь 40 мл раствора уреазы в 0,3М фосфатном буфере (ферментативная активность 39500 ед/мл, содержание белка 115 мг/мл) и эмульгируют 20 мин при механическом перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 2 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин, затем добавляют 8 г триацетата целлюлозы и перемешивают (50 об/мин) до полного растворения около 2 ч. Из полученного прядильного раствора формуют пленки по сухому способу при 20оС. Ферментативная активность полученного препарата 22560 ед/г сухой пленки, эффективность иммобилизации 20,9%
П р и м е р 8. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 20 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл) и 1,6 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида. Эмульгирование проводят при 20оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают и сушат. Эффективность иммобилизации 20%
П р и м е р 9. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл полиакриламида (200 мг/мл), 0,4 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида и 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл). Эмульгирование проводят при 20оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение часа при 20оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 14%
П р и м е р 10. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 10 г триацета целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл полиэтиленимина (250 мг/мл), 0,4 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида и 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл). Эмульгирование проводят при 20оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 14%
П р и м е р 11. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 20 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 5 мг/мл) и 1,6 мл 2,5% водного раствора ди-4,4'-(4''-6''-дихлор-S-триазинил)-аминостильбен-2,2'-ди- сульфокислоты. Эмульгирование проводят при 20оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 5% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20оС. Пленки формуют по сухому способу. Далее пленки промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (pH 3) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 27%
П р и м е р 12. Прядильный раствор получают по следующей методике.
К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл), 10 мл водного раствора полиэтиленимина с концентрацией 250 мг/мл и 1,6 мл 2,5% водного раствора ди-4,4'-(4''-6''-дихлор-S-триазинил)-аминостильбен-2-2'-дисульфокислоты. Эмульгирование проводят при 20оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 5% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20оС. Пленки формуют по сухому способу. Далее пленки промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 20%
Таким образом, предложенный способ позволяет существенно повысить эффективность иммобилизации и ферментативную активность иммобилизованного фермента по сравнению с соответствующими характеристиками гетерогенных биокатализаторов, полученных по способу-прототипу. Например, при иммобилизации трипсина по способу-прототипу эффективность иммобилизации составляет 14% а по предлагаемому способу до 27% При иммобилизации пенициллинамидазы по предлагаемому способу получают гетерогенные биокатализаторы с активностью до 60 тыс. ед/г (при эффективности иммобилизации 57,9%), в то время как по прототипу получают катализаторы с активностью до 30 тыс. ед/г (эффективность иммобилизации 41%).
При иммобилизации уреазы по способу-прототипу получен катализатор с активностью 800 ед. (при эффективности иммобилизации 2,1%), а по заявляемому способу катализатор с активностью до 31,4 тыс.ед. (при эффективности иммобилизации 53%).
Заявка
2636514/05, 30.06.1978
Московский текстильный институт, Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков
Роговин З. А, Вирник А. Д, Седов А. А, Красовская С. Б, Кильдеева Н. Р, Скокова И. Ф, Савицкая Е. М, Ныс П. С, Булычева М. С, Милешин Ю. Н
МПК / Метки
МПК: C12N 11/02
Метки: биокатализаторов, гетерогенных
Опубликовано: 27.10.1995
Код ссылки
<a href="https://patents.su/0-845476-sposob-polucheniya-geterogennykh-biokatalizatorov.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения гетерогенных биокатализаторов</a>
Предыдущий патент: Мокрый пылеуловитель
Следующий патент: Способ рекультивации нарушенных при добыче угля земель
Случайный патент: Сборный режущий инструмент