Способ получения азотсодержащего полисахарида, промотирующего чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антибиотикам

Союз Советскик Социалистически к Республик(23) Приоритет (31) 52-41513 С 12 0 13/04А 61 К 31/715 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 01,0181 Иностранцы Тикао Есикуми, Есио Омура, Тецуя Хотта(72) Авторы изобретения Иностранная ФирмаКуреха Кагаку Когио Кабусики Кайся(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАцЕГОПОЛИСАХАРИДА, ПРОМОТИРУ 0 ЦЕГОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ЛЕКАРСТВАМУ БАКТЕРИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К АНТИБИОТИКАМ Азотсодержащий полисахарид, полученный вышеописанным способом, обладает следующими свойствами,Физико-химические сгяойства. Изобретение относится к Фармацевтической промышленности и касаетсяполучения препаратов, пролонгирующихдеиствия лекарственных средств.Предлагаемыи препарат новый и способ его получення в научно-технической и патентной литературе не описан.Целью изобретения является получение азотсодержащего полисахарида,промотируюшего чувствительность к 1 Олекарствам у бактерий, устойчивыхк антибиотикам.Эта цель достигается тем, чтоштамм СМ -105 Сог 1 оцв ч егв 1 со 1 ог (гг)Яце или штамм СМСог 1 о 1 цв Н 1 гвсцв 5(гг) 0 це выращивают в питательнойсреде, отделяют мицелий, высушиваютего и измельчают и экстрагируют горячим водным растворителем.Кроме того, в качестве водного 20растворителя используют 0,1 н раствор гидроокиси натрия,Способ осуществляют следующим образом,Мицелии базидиальных грибов, принадлежащих к виду Сог 1 о 1 цв, которыеиспользуют в качестве исходного материала для экстракции, могут бытьполучены как ее тес 1 венным путем, таки посрелством иск; огненного культи вирования. В случае искусственного культивирования грибов путем использования жидких сред в качестве исходного материала для последующей экстракции используют все продукты культивирования, включая не только продуцируемый мицелий, но также элюат в жидкой среде после культивирования,Полученный исходный материал экстрагируют водным растворителем и экстракт подвергают затем последовательной обработке, такой как Фильтрация, нейтрализация, концентрирование фильтрата, диализ, обессоливание и т,д., с целью удаления из этого экстракта низкомолекулярных веществ (с молекулярным весом ниже 5000 ), после чего конечный раствор высушивают с целью получения порошкообразного вещества. Полученное таким образом порошкообразное вещество представляет собой азотсодержащий полисахарид и может быть использовано в качестве активного компонента.Вещество представляет собой порошкообразный и коричневый по цвету материал, который не имеет определенной температуры плавления и карбонизуется при сильном нагревании. Оно не растворяется в органических растворителях, таких как пиридин, хлороформ, бензол, гексан и т.д., но растворяется в воде. Инфракрасный спектр этого вещества характеризуется наличием полос поглощения в области 3600-3200 см2920-2900 см , 1660-1610 см , 1460 см,1410 см , 1360 см " 1230 см ", 1150 см1080 см", 1060-990 см, 925 см ,890 см ", 840 см , 755 сми 705"см , 5Таким образом, в ИК-спектре азотсодержащего полисахарида имеется полоса поглощения в области 890 смхарактерная для -связей глюкана в сахаридной части молекулы, и другая полоса поглощения в области 840 смхарактерная для А-связей глюкана.Элементарный анализ азотсодержащего полисахарида показывает следующий состав вещества: содержание углерода от 42 до 46, содержание водорода от 5,3 до 7,0 и содержание азота от 0,5 до 8,0. Все остальное побалансу приходится на долю кислорода.Оптическое вращение азотсодержащего полисахарида, определенное стандартным методом и выраженное черезвеличину удельного. оптического вращения А р варьируется от 0 до 50 О .Аэотсодержащий полисахарид даетположительную реакцию с фенолсернойкислотой, положительную реакцию - сантронсерной кислотой и положительную реакцию с нингидрином. Тот факт,что это вещество дает положительные 40цветные реакции с указанными реагентами, является свидетельством того,что активное вещество включает всвоем составе сахаридную и белковуючасть, т.е. является гликопротеином. 45Для определения углеводного составаазотсодержащего полисахарида образецвещества гидролизуют метанольнымраствором хлористоводородной (соляной ) кислоты и, после триметилсилилирования известным методом, анализируют гидролизат - методом гаэо-жидкостной хроматографии. Результатыанализа показали, что полисахаридсостоит в основном из глюкозы, а также содержит маннозу, галактозу,55ксилозу и фукозу. Ьминокислотный анализ белковой части азотсодержащего полисахарида позволил определить, чтобелковая часть вещества включаетв своем составе аспарагиновую кислоту, д 0треонин, серии, глутаминовую кислоту, пролин, глицин, алании, цистин,валин, метионин, изолейцин, лейцин,тирозин, триптофаи, фенилаланин,лизин, гистидин и аргинин.Основная 65 доля среди этих аминокислот приходится на аспарагиновую кислоту, треонин,глутаминовую кислоту, глицин, аланин,валин и лейцинСуммарная доля этихаминокислот от общего аминокислотногосостава составляет более 70.Исследование азотсодержащего полисахарида методом. ядерного магнитного ,резонанса проводят с целью определе-ния отношения между углеводной (сахаридной) и белковой частями в указанном веществе, а также для, уточнения типа связей в углеводной части этого вещества.Спектр протонного магнитного резонанса (ЯМР-спектр) образца азотсодержащего полисахарида снимают на ЯМР-спектрометре с напряженностью магнитного поля в 100 мегагерц, используя в качестве растворителя тяжелую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-силанопентан-сульфонат. В спектре ЯМР исследуемого вещества имеются полосы поглощения в области 0,90,2-1,20,2 миллионных долей, 2,0+0,2 миллионных долей, 4,5+0,2 миллионных долей, 4,70,2 миллионных долей, 5,00,2 миллионных долей и 5,40,2 миллионных долей соответственно, в спектре видна также широкая полоса поглощения в области 3,4-4,4 миллионных долей. Белковая компонента вещества изучена, исходя из допущения, что область от 0,5 до 2,5 миллионных долей ,связана с интенсивностью сигналов :ротонов белковой части образца, а область от 2,5 до 6,0 миллионных долей связана с интенсивностью сигналов протонов углеводной (сахаридной) части образца. При этом доля белковой части была оценена менее чем в 40. Исходя из того, что область. от 4,4 до 4,9 миллионных долей связана с ф-связями в сахаридной части образца, а область от 4,9 до 5,4 миллионных долей связана с А-связями, удалось определить, что их отношение, т.е. отношение числа-связей к числу А -связей в полисахаридной части гликопротеина варьируется от 85/15 до 40/60Молекулярный вес аэотсодержащего полисахарида, измеренный методом ультрацентрифугирования, варьируют для различных образцов исследуемоговещества в диапащоне от 5000 до 300000Испытания азотсодержащего полисахарида на острую токсичность проводят на мышах линии 1 СК-ЗСЬ, имеющих возраст от 4 до 5 недель и весящих от 21 до 24 граммов, и на крысах линии Донриу, имеющих возраст от 4 до 5 недель и весящих от 100 до 150 граммов. Азотсодержащий полисахарид растворяют в физиологическом солевом растворе и вводят животным внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно иВнутривенныи 1300 1300 Подкожный ф 5000 5000 Внутрибрюшинный 5000 5000 Пероральный 20000 2000 Внутривенный 600 б 00 Подкожный 5000 5000 Внутрибрюшинный 5000 5000 ыш Пероральный 20000 20000К числу антибиотиков, которые проявляют свое действие против резистентных к лекарственных препаратам бактерий в комбинации с азотсодержащим полисахаридом, относятся антибиотики, выделенные из плесеней, плес невых грибов, бактерий, актиномицетов и других микроорганизмов. Типичные примеры таких антибиотиков перечислены ниже:Пенициллин "6"(ниже он сокращенно обозначен как РМСтрептомицин (5 М)Канамицин (КМ)Хлорамфеникол (СР)Тетрациклин (ТС)Эритромицин (ЕМ)Аминобензилпенициллин (АВРС)Цефалоридин (СЕ)Колистин (СЕ 1)Эффект, вызываемый азотсодержащим полисахаридом, состоит в промотировании (стимулировании) чувствительности к лекарствам у следующих резистентных к лекарственным препаратам (антибиотикам ) бактерий;ЕьсЬег 1 сЬ 1 а со 115 сгерососсца 1 аеса 11 ь5 СсерЬу 1 ососсца ацгецаЕпегоЬасйег аегодепеь5 а 1 еопе 11 а епгег 11 деь5 Ь 1 де 11 а 5 оппе 1К 1 еЬь 1 е 11 а рпсц опаеРогець п 1 гаЬ 111 аРаецдопопа а.гцд 1 поьа перорально. Общие симптомы воздействия вещества на подопытных животных, гибель животных и изменение их веса наблюдают в течение 7 дней, после чего животных забивают и проводят аутопсию (вскрытие трупов ), В результате проведенных испытаний не было зафиксировано ни одного случая гибели животных, ни на крысах, ни на мышах, даже при введении им самой вы-, сокой дозы из тех, что показаны на приведенной ниже таблице 1.В табл. 1 представлены вводимые дозы азотсодеркащего полисахарида.Т а б л и ц а 15 мов, резистентных к соответствующим лекарственным веществам (антибиотикам ).Лекарственную чувствительность штаммов, резистентных к антибиотикам, и первоначальных штаммов тех же бактерий (чувствительных штаммов ) сравнивают путем нахождения миним ной ингибирующей концентрации, т.е. минимальной концентрации соот щего лекарственного соединения, бирующей рост бактерий,:ближе эта личина сокращенно обозначена как МИК) .Ьыли приготовлены двойные разбавленные системы каждого лекарства, которые смешивают с агаровой средой для вливаний с целью подготовки чашек с агаровой средой. Затем отбирают петелькой образец каждого штамма, который культивируют при 37 С на Трипто-соевом бульоне в течение 18 ч и наносят мазком на каждую чашку. После культивирования в течение 18 ч при температуре 37 оС в каждой чашке проверяют степень роста инокулированного бактериального штамма.Для того, чтобы увидеть, насколько изменяется минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для каждого реэистентного штамма при комбинированнбм использовании полисахаоида и соответствующих антибиотиков (тех, которые перестали действовать на определенные бактериальные штаммы), проводят процедуру, аналогичную вышеописанной, с тем исключением, что в системы добавляют, с целью получения соответствующих комбинаций, от 10 до 1000 микрограммов/мл азотсодержащего полисахарида, и величину МИК определяют в соответствии с выальветствую. -инги- ве 5 10 22 Действие азотсодержащего полисахарида по стимулированию чувствительности к лекарствам у резистентных к антибиотикам штаммов бактерий подтверждено следующим образом.Резистентнье к антибиотикам штаммы бактерий получены с помощью метода, описанного ниже, при выращивании культуры в градиентной чашке (в чашке Петри с концентрационным градиентом соответствующего антибиотика ).Чашки Петри с агаровой средой и с концентрационным градиентом лекарсвенного вещества в диапазоне от 10 до 100 микрограмм/мл подготавливают надлежащим образом и используют для инокуляции бактерий каждого штамма методами штриховой разводки или мазка. Эти чашки инкубируют при 37 С во течение нескольких дней и колонии бактерий, сформировавшиеся в области высокой концентрации антибиотика, отделяют и снова инокулируют аналогичным образом в другие чашки. Подобную операцию повторяют несколько раз с целью получения бактериальных штам 7934085 1 О 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 60 65 шеупомянутым методом, основанном наиспользовании чашек с агаровой средой и концентрационным градиентомантибиотиков,При этом наблюдается отчетливовыраженный эффект - величина минимальной ингибирующей концентрации(МИК ) уменьшалась в результате прибавления аэотсодержащего полисахарида по крайней мере на половинупо сравнению с уровнем, который фиксировался до прибавления, или дажееще ниже. Количество прибавляемогоазотсодержащего полисахарида составляет более 10 микрограммов/мл, а впредпочтительном варианте - более100 микрограммов/мл. Величину рНсреды поддерживают при этом на уровне 7,2-0,1 с тем, чтобы на определяемую величину МИК не оказывало влияние рН среды. Кроме того, используя метод культивирования в условияхразбавления агаровой среды, аэотсодержащий полисахарид сам по себе необладает антибактериальной активностью против бактериальныхштаммов,отобранных для проведения испытаний.Терапевтический тест по воздействию на инфекционные заболевания проводят следующим образом, Подопытноймыши вводят внутрибрюшинно, с цельюзаражения, 1 х 108 клеток лекарственнорезистентных бактерий. Через 1-3 чпосле этого мышам вводят либо внутрибрюшинно, либо перорально от 10до 1000 миллиграммов на килограммвеса тела мыши соответствующеголекарства и от 1 до 10 миллиграмммов/кг азотсодержащего полисахарида,Наблюдение за подопытными животными продолжают в течение 7 дней послевведения с целью изучения их выживаемости и оценки эффективности действия азотсодержащего полисахарида,Выло обнаружено, что эффективная доза вещества настоящего изобретенияв предпочтительном варианте составляет более 10 мг/кг при внутрибрюаинном введении, и более 100 мг накилограмм при пероральном введении.Это было выше, чем 40,Азотсодержащий полисахарид способен усиливать терапевтический (лечебный) эффект лекарственных препаратов не толькр в опытах п ч 1 гонотакже и в химиотерапии инфекционныхзаболеваний, т.е. в опытах 1 и чнос рядом резистентных штаммов болезнетворных бактерий.Азотсодержащий полисахарид проявляет также чрезвычайно низкую острую токсичность и может вводитЬся ворганизм различными путями, в частности посредством внутрибрюшинныхинъекций, путем подкожного введения, пероральным путем и ректальнымпутем (через прямую кишку), Такимобразом, аэотсодержащий полисахаридможет быть смешан с антибиотиком при,проведении курса лечения этим лекарственным препаратом или же может вводиться в организм отдельно.Когда азотсодержащий полисахарид предполагается вводить пероральным путем и его оформляют в виде таблеток, гранул, порошков, капсул и других лекарственных форм для перорального введения, рецептура любого такого препарата может содержать различные добавки того типа, которые обычно используются при получении лекарственных препаратов и, в частности связующий агент, эксципиент ( воспринимающее средство), смазывающее вещество ( замасливатель), дезинтегрирующий агент, смачивающий агент и т,д. Когда азот- содержащий полисахарид используется в виде жидкости для перорального введения, он может быть приготовлен в виде жидкого лекарственного средства для внутреннего применения, такого, например, как взбалтываемая микстура, суспензия, эмульсия, сироп и т.д или же может быть получен в виде сухого продукта, который подвергается растворению непосредственно перед использованием, Такие жидкие препараты могут также содержать в своем составе различные добавки и/или консерванты того типа, который обычно используется при получении лекарственных препаратов, Растворы для инъекций могут содержать в качестве добавок вещества-стабилизаторы, буферные (забуферивающие) вещества, консерванты, вещества для создания изотоничности раствора и т.п. Такие растворы для инъекций могут быть расфасованы в ампулы однократного использования, рассчитанные на введение определенной дозы активного ингредиента за один раз или во флаконы, содержащие не одну, а несколько доз препарата, Кроме того, вышеупомянутые композиции (рецептуры) могут выпускаться в виде водного раствора и или суспензии, а также в виде раствора или эмульсии в масляном или водном разбавителе при условии, что активный компонент может быть в виде порошка, который растворяется в таком разбавителе, например, в стерилизованной непирогенной воде, непосредственно перед использованием. В случае, когда полисахарид используется в виде мази или средства для втирания, он может содержать соответствующую масляную или жировую основу, эмульсивную основу, водорастворимую основу,.консервант и другие подобные вещества и/или добавки.П р и м е р 1. Приготавливают жидкую питательную среду следующего состава, г:Пептон 5Дрожжевой экстракт 3КНРОс 0,3К НРО 0,3О,з50До 1 литра ГлюкозаВодарН:6,0Аликвоту этой среды объемом 150миллилитров вводят в каждую из 100конических колб емкостью 1 литр, ипосле закупорки каждой колбы ватнойпробкой жидкую среду подвергают стерилизации в течение 30 мин при 120 ОС и затем вносят в каждую колбу (инокулируют ) посевной материал - отдельнокультивированнный на скошенном агаремицелий базодиомицета Согоиь чег 5 соог (фр.), штамм (1 ое 1 СМ,после. чего осуществляют стационарную 15 этого сухого продукта измельчают и экстрагируют 0,1 н раствором гидро- окиси натрия при температуре 95-98 О С,при обычном давлении, в течение 3 ч,используя для этой цели экстракториз нержавеющеи стали. Полученный таким образом щелочныи экстракт нейтрализуют, подвергают фильтрации и полученный фильтрат концентрируют затем до остаточного объема, равного 500 миллилитрам, Этот концентрированный раствор помещают затем в целлофановый мешочек и подвергают диализу против проточной воды в течение 90 ч.Полученный диализат концентрируют при пониженном давлении и концентрированный раствор подвергают затем распылительной сушке, в результате. которой получают 19,5 г порошкообразного продукта. 40 Для изучения свойств этого порошкообразного продукта небольшую его порцию подвергают элементарному анализу с использованием С, Н, М-анализатора (СНМ-СОСОКОЕН), в результате чего найдено, что в состав вещества 45 входит 42,1 углерода, 6,0 водорода и 5,8 азота. Определение удельногооптического вращения образца полученного продукта производят для 0,25 ного водного раствора этого вещества с использованием поляриметра "УАМАКО-ОК", Измерения показали, что удельное оптическое вращение этого продукта равняется +12 ф.Для того, чтобы узнать углеводный (сахаридный ) состав этого продукта, образец весом 10 миллиграммов прибавляют к 3-ному метанольному раствору хлористоводородной кислоты и метанолиз проводят в течение 16 ч при 0 температуре 100 фС, После нейтрализации соляной кислоты карбонатом серебра реакционную смесь профильтровывают при комнатной температуре иполученный фильтрат сначала конкультивацию инокулята в течение20-дневного периода при температуре вдиапазоне от 25 до 27 С. Полученныйтаким образом культуральный шламм(бульон) высушивают в барабанной сушилке, в результате чего получают 20451 грамм сухого продукта. 150 граммов центрируют, а затем упаривают досуха. Полученный при этом твердый продукт растворяют в 0,5 миллилитрах пиридина, к раствору прибавляют 0,2 милли- литра гексаметилдисилазана и 0 3 милУ лилитра триметилхлорсилана и реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин для завершения реакции триметилсилилирования. Продукт растворяют затем в хлороформе, и после отмывки избытка реагента и дегидратации фильтрат упаривают досуха, Затем этот продукт растворяют в четыреххлористом углероде и подвергают анализу методом газо-жидкостной хроматографии. ГЖХ-анализ показал, что продукт состоит из 70,5 глюкозы, 3,8 галактозы, 10,3 маннозы, 5,4 ксилозы и 10,0 фукозы.Для определения аминокислотного состава белковой части порошкообразного продукта его образец подвергают аминокислотному анализу в соответствии со стандартным методом Мура и Итейна, В результате аминокислот- ного анализа получают следующий состав; 15 аспарагиновой кислоты, 8 треонина, 6 серина, 14 глутаминовой кислоты, 4 пролина, 8 глицина, 10 аланина, 4 изолейцина, 6 лейцина, 1 тирозина, 4 фанилаланина, 2 триптофана, 2 лизина, 3 аргинина, 4 аммиака и 1 М -глюкозамина, а также следы гистидина. Для исследования продукта методомЯМР-спектроскопии в качестве растворителя используют тяжелую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2- -диметил-силанопентан-сульфонат, причем для устранения любого возможного влияния на результаты анализа остаточного количества легкой воды, содержащегося в тяжелой воде, используют величины, которые подверглись коррекции, проделанной на основе предполагаемой кривой Лоренца, В этих условиях отношение доли углеводной части вещества к его белковой части было определено, исходя из допущения, что поглощение в области 0,5-2,5 миллионных долей обусловлено протонами белковой части продукта, тогда как поглощение в области от 2,5 до 6,0 миллионных долей относится к протонам углеводной (сахаридной ) части продукта. Полученное отношение угле- водной части к белковой рав 89:11.Кроме того, полоса поглощения 4,1- 4,9 миллионных долей связана с ф-связями сахаридной части, а полоса поглощения в области 4,9-6,0 миллионных долей связана с -связями саха- рида, анализируя ЯМР-спектр продукта, определяют также отношение доли 5-связей к доле А-связей в полисахаридной части продукта, Это отношение (,б/А ) равно 65:35.,6 100 Е 5 Ь9 е 11 а зоппе 1 КМ К 1 еЬье 11 а5 рпецщопае 10 25 О,2 М 0 РгоСецЬ 111 ь 8 5 В Рьецдоеопа аегц,9 поза ктерии т ирующейа (РС) Веконце вычис 1,667 45 ч 5 сарЬ 1 ососсцьацгецз 0,025 1 СР 3 ТС 0 ЕМ 0 5 М 1 а-ТС О 8 25 4 12, 6 100 4 25 Для того, чтобы увидеть изменениевеличины минимальной ингибирующейконцентрации (МИК) для соответствующих, резистентных к лекарственнымпрепаратам штаммов бактерий при совместном использовании предлагаемоговещества и различных антибиотиков (тех,которые использовались для выработкирезистентности у бактерий), азотсодержащий полисахарид прибавляют в 60 культуральную среду в количествах от10 до 1000 микрограммов/мл и величины МИК получают в соответствии с методом культивирования в чашках с агаровой средой. Полученные результаты 65 представлены в табл. 3. 5 герососсеса 1 вЕьсЬег 1 сЬ 1 а 12,5 1 о 5 М 3,1 КМ 6,3 0 0 Р 1,6 50 С 3,1 25 Т 1 25 00 Молекулярный вес исследуемого продукта определяют посредством ультрацентрифугирования его раствора, причем измерение проводят с использованием седиментационно-равновесного метода и синтетической граничной модели (картинки). Для этой цели используют интерференционную оптическую систему, причем измерения проводят вследующих условиях: концентрация образца в растворе 0,3; растворительМ/10 КСЙ, температура 25 оС; столбик 10жидкости высотой 1,7 миллиметра;скорость вращения ротора 22000 об./минпродолжительность измерения 5 ч. Полученное значение среднего молекулярного веса вещества равно 100000. 15Испытания продукта на эффективность стимулирования лекарственнойчувствительности у резистентных к лекарственным препаратам бактерий, которые, в частности, приобретают резистентность к антибиотикам, проводятследующим образом,Образцы резистентных к лекарственным препаратам бактерий получают согласно вышеупомянутой методике культивирования бактерий в чашках с концентрационным градиентом антибиотйковв агаровои среде при использованиибактерий 5 арЬу 1 ососсць ацгецв, 5 герсососсць 1 аеса 11 ь, ЕьсЬег 1 сЬ 1 а со 1,5 а 1 щопе 11 а епйег 1 г.1 д 1 ь, К 1 еЬзе 11 а ЗОрпецаоп 1 а 1, Рьецдощопаь аегц 9 поза,Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков для исходныхбактерий и тех бактерий, которые приобрели резистентность устойчивость) 35к лекарствам, приведены в табл. 2.Таблица 2 ичины минимальнои ингитрации (МИК ) пенициллиены, исходя из допущенЕ (единицы ) = 1 мг. Величины МИК цефалоридина (.С ) вычислены, исходя из допущения, что 30000 Е (единиц) = 1 мг,793408 14 5 сарЬу 1 ососсцацгецьРС-геь 1 СапС мл 12,5 б,3,С- МЕ 5 йгерйососсць1 аеса 11 вТС-ген ьСапС 6,0 ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 115 М-гея 1 ьг.ап 1 100 00 0 0 б,Т 12,Еп СегоЬас 1 е гаего 9 ецеь КМ-геь 1 ьап. 100 2 12,0 К 1 еЬь 1 е 11 арпецщоп 1 а 1 5 М-геь 1 ьСап 1000 100100 25 6,100 25 2,Т 5 Ь 19 е 11 ьоппе КМ-геь 1 ьйапСРгоець в 1 гаЬ 1 12 000 КМ РС-геь 1 ьап 12,5 ВР Рьецдопопаяаегц 91 поьаС-геь 1 вйап 1000 обретенияьную среду.обретенияральную Вещество настоящего и прибавляли в культура фВещество настоящего ине прибавляли в культ среду. а м а 1 в псе Р - г пе 1 1 а111015ь 1 яВап РС100 СР 100 Таблица 335. П р и м е р 2. Испытания по выявлению терапевтического (лечебного ) воздействия на инфекционные заболева ния проводят на пяти группах самцов мышей линии 1 СЙСЕ (каждый иэ которых весил 221 грамм), причем каждая группа состоит из 10 мышей, при использовании резистентного к пенициллину С штамма бактерий 5 герсососсць, полученного в примере 1,Этот резистентный к пенициллину С-штамм ацгець, который культивировался на Трипто-соевой агаровой среде при температуре 37 оС в течение 18 ч, суспендируют в Трипто-соевом бульоне, содержащем 5 муцина, и 0,25 милли- литра такой суспензии вводят (ино кулируют ) внутрибрюшинно каждой подопытной мыши. Заражение регулируют таким образом, чтобы каждая мышь получала в инокуляте 5 х 108 клеток бактерий. Через двд часа после эа ражения (,инокуляции )мышам вводят внутрибрюшинно пенициллинв дозе 2,5 х 10 единиц/кг веса тела мышей и 5 х 10 Е/кг соответственно, Одновременно мышам вводят внутрибрюшинно азотсодержащий полисахарид, полученный в соответствии с методикой примера 1, в дозе, равной 100 мг/кг веса тела. Обработанные таким образом мыши находятся под постоянным наблюдением каждый день в течение 7 дней после введения с целью определения выживаемости зараженных мышей, Комбинированное использование антибиотика и азотсодержащего полисахарида (ИР/) может существенно улучшить лечебное действие пенициллина Е 1 за счет повышения чувствительности к пенициллину 6 резистентных к нему 1 и ч 1 чо бактерий.П р и м е р 3. Аналогичный тест 40 на терапевтическую эффективность в лечении инфекционных заболеваний проведен на, пяти группах самцов мышей линии 1 СЙСЕ (каждая мышка весит 12 ф 1 грамм, причем каждая группа 45 подопытных животных состоит из 10 мышей) при использовании резистентного к сетрациклину штамма Е.со 1 и азотсодержащего полисахарида, полув ооответствии с дй, 50 описанной в примере 1. Для заражения каждой мышкй вводят внутрибрюшинно 0,25 мл Трипто-соевой бульонной суспензии, включающей 5 муцина,резистентных к тетрациклину бактерий,приготовленной как описано в примере 1. Инокулирование регулируют таким образом, чтобы каждая Вмышка получила внутрибрюшинно 5 х 10 клеток бактерий. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят перорально тетра циклин в дозах 80 мг/кг веса тела и160 мг/кг соответственно. Одновременно мышам вводят пероральным путем аэотсодержащий полисахарид в дозе 100 миллиграмм/кг. Комбинированное 65 использование азотгодержащего полисахарида и тетрациклина способно вызывать значительно более, высокий лечебный эффект, чем использование одного тетрациклина. Кроме того, поскольку практически один и тот же эффект может быть достигнут как при пероральном введении вещества, так и при внутрибрюшинном его введении, вещество может найти самое широкое применение вследствие его высокой эффективности.П р и м е р 4. Резистентный к пенициллину "С" штам 51 арИу 1 ососсць ацгець инокулируют пяти группам (по 10 мышей в группе) мышей-самцов линии 1 СЙСЕ, каждый иэ которых имет вес 22+1 грамм, с нагрузкой 5 х 10 клеток на каждую подопытную мышку, следуя методике примера 2. После этого четырем группам мышей вводят внутрибрюшинно 2,5 х 10" Е/кг пенициллина "С" и соответственно 1, 10, 100 и 1000 мг/кг азотсодержащего полисахарида (того же, что используют в примере 1), Ежедневные наблюдения за подопытными мышами велись в течение 7 дней после введения указанных препаратовП р и м е р 5. Осуществляют аналогичный опыт по лечению инфекционных заболеваний с использованием б групп из самцов-мышей 1 СЙСЕ,причем каждая группа, состоящая из 10 мышей, инокулированных клетками устойчивых к тетрациклину бактерий Е.Со 11 в количестве 5 х 100000000 клеток на мышь, с использованием процедуры примера 3.Через два часа после инокуляции вводят тетрациклин в дозе 80 мг на кг веса тела мыши с одновременным оральным введением азотсодержащего полисахарида,используемого в примере 1, в соответствующих дозах О, 10,100, 1000 и 10000 мг/кг, при этом шестая группа была контрольной, Обследование мышей проводилось ежедневно до 7-го дня.П р и м е р б, Штамм СМбазидиомицета Сог 1 о 1 ць Ьгьц 1 ць (фр.) Яце 1 (Гегщ.Йеь.1 пьй,Оероь 1 с М- ГЕЙМ-Р 2711) культивируют, как в примере 1, и затем экстрагируют и очищают в соответствии с аналогичной методикой, в результате чего получают 17,5 грамма порошкообразного вещества. Свойства этого вещества следующие:Элементарный анализ; 43,7 углерода; 6,4 водорода и 5,5 азота, Удельное оптическое вращение:4/ц -Н 793408 17 Формула изобретения Составитель С. МалютинаРедакто Г. Прусова Техред М.Голинка Корректор М. Шараши Заказ 9638/69 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патейт", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Аминокислотный состав белковойчасти: 15 аспарагиновой кислоты, 9треонина, 5 серина, 14 глутаминово)3кислоты, 6 пролина, 9 глицина,9 Ъ аланина, 7 валина, 1 метионина,5 изолейцина, 6 лейцина, 2 триптофана, 4 фенилаланина, 2 лизина,3 аргинина, 2 аммиака, 1 глюксзамина и следовые количества цистина,тирозина и гистидина.Полученное таким образом вещество,имеющее вышеупомянутые характеристики, используют для проведения следующего эксперимента.По аналогии с примером 1 получаютрезистентный к хлорамфениколу штамм5 а 1 аопе 1 а епйег 1 с 1 дЪ. Затем 0,25миллилитра суспензии вышеупомянутыххлорамфеникол-резистентных бактерийв Трипто-соевом бульоне (см. пример 2),включающем 5 муцина, инокулируютвнутрибрюшинно пяти группам мышей(каждой мышке ), причем каждая из этихгрупп состоит из 10 животных, Каждойподопытной мышке вводят 1 х 10 кле 6ток, Через 25 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшиннс по50 миллиграмм/кг хлорамфеникола, Мышам другой группы помимо этого вводят перорально азотсодержащий полисахарид в дозе 500 мг/кг. В группе,где мышкам вводили один хлорамфеникол, выживаемость через 5 дней послевведения составила 40, тогда как вгруппе, где антибиотик давали в ком-бинации с азотсодержащим полисахаридом, выживаемость оказалась на уровне80,П р и м е р 7. По методике примера 1 получают резистентный к стрептомицину штамм К 1 еЬе 11 а рпецщоп 1 а 1;0,25 миллилитра Трипто-соевого бульона (см. пример 2), содержащего 5муцина и указанные резистентные бактерии, инокулируют внутрибрюшинноподопытным мышам, образующим 2 группы по 10 мышей в каждой, выдерживаянорму порядка 1 х 10 клеток на кажВдую мышку. Через 3 ч после этой инокуляции мышам вводят внутрибрюшиннопо 100 мг/кг стрептомицина. Мышамодной группы вводят кроме того по120 мг/кг азотсодержащего полисахарида, полученного в соответствии сметодикой, описанной в примере 6, используя внутрибрюшинный путь введения. Через 6 дней после введения выживаемость мышей в группе, где животным вводили один стрептомицин,составила 50, тогда как в группе,где мышам вводили стрептомицин в комбинации с полисахаридом, выживаемостьоказалась намного выше (около 80),П р и м е р 8. 0,25 мл суспензииколистин-резистентных бактерий Рьецдовопаь аегц 9 пеа,культивированныхв соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 1, в Трипто-соевом бульоне (см. пример 2), содержащем 5 Ъ муцина, инокулируют внутрибрюшинно подопытным мышам-самцамлинии Сй - С 1, каждая весом2211 грамм, распределенным в 2 груп пы по 10 мышей в каждой, выдерживаянорму введения 1 х 108 клеток на каждую мышку. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшинно антибиотик колистин вдозе 190 мг/кг Щ (1 микрограмм = 30 единицам ). Помимоэтого мышам одной группы вводят такжеперорально азотсодержащий полисахарид,полученныи по методике, аналогичнойописанной в примере 6, в дозе 1500 мг//кг. Через 6 дней после введения выживаемость мьпцей в группе, где имвводили один клистин, составила 40,тогда как в группе, где колистин применялся в комбинации с предлагаемымвеществом, выживаемость мышей оказалась равной 70 Ъ.Предлагаемый способ позволяет получить азотсодержащий полисахарид,промотирующий чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антион-тикам. 1. Способ получения азотсодержа щего полисахарида, промотирующегочувствительность к лекарствам у бактерий,. устойчивых к антибиотикам,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоштамм СМСог 1 о 1 ц чего соог(Ег),Оце или штамм СМСогоца 45 Ь 1 гьцсць (Рг) Оце 1 выращивают в питательной среде, отделяют мицепий,высушивают его и измельчают и экстрагируют горячим водным растворителем.50 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве водного растворителя исгользуют 0,1 нраствор гидроокиси натрия.