Способ определения стресс-реакции

(51)5 (э 3/58,К 47 0 ОБРЕТЕ ПИСАН И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ венный и А,В.КороСРблик, 19 ва 87. во 8,Я СТРЕСС-РЕогия, медицина. тся повышение ь изобретения: в тение относится к медицийе и в именно к методам исследоваитарных транспортных систем. ы способы оценки стресс-реакопределения объема кровотока ой мозг и константы скорости я кислорода тканями мозга, анаокардиограммы. Изобре физиолотий ния эритроцИзвестн ции путем через-голбв потреблени лиза электр Наиболее близким к изо ется способ определения ре ма на воздействие стресса основанный на определении фосфатазы, катепсина Д и щ тазы в периоды относитель нального покоя и действия повышении активности ферм ях стресса менее чемна 20% нормальную реакцию орган личении более чем на 20% - реакцию,ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Свердловский государцинский институт(57) Использование: физиолЦелью изобретения являеточйостиспоСоба, Сущност бретению явля- акции организрных факторов, в крови кислой елочной фосфа- ного функциострессора. При ентов в условиустанавливают изма, а при увепатологическую -качестве инкубационой сред с мечеными биологически ак ствами (БАВ) используется о среда органов и тканей, в ко дит эритроцитарный обмен околоклеточная среда, вза эритроцитами, вызываетБАВ, активно используемых достаток которых имеется в с единение к эритроцитам БАВ околоклеточной среде в избь лирует условия обмена БАВ окончании инкубации эритр ют от инкубационной среды руют. 5 табл. ы эритроцитов тивными вещеколоклеточная торых происхо- БАВ. При этом имодействуя с отсоединение тканями (и нереде), и присо, имеющихся в тке, что модев тканях. По оциты отмываи радиометриНедостатком способа является низкая точность оценки, Последнее обусловлено широкими пределами колебания концентрации ферментов в зависимости от возраста, режима питания, наличия заболеваний, в том числе хронических, групп крови (Клиническая оценка лабораторных тестов/Под ред, Н,У.Тица. М.: Медицина, 480 с).Целью изобретения является повышение точности способа.Цель достигается тем, что в способе, включающем исследование биологически активных веществ БАВ) крови, эритроциты помещают в биологические жидкости организма, в которые дополнительно вносят меченые БАВ, и при определении отношения приращения связыванйя с-эритроцитами БАВ менее 0,63 устанавливают начальную стадию стресс-реакции, а при значении более 1,37 устанавливают стадию поврежде ния клеточных мембран, 1783440Увеличение точности способа происходит-за счет того, что начальная стадиястресс-реакции, сопровождающаяся изменением состава и свойств биологическихжидкостей, вызывает снижение взаимодействия эритроциты-меченые БАВ, а развитие .стресс-реакции, сопровождающееся повреждением клеточных мембран (повреждение липидного бислоя); приводит кповышению взаимодействия эритроциты -меченые БАВ (в результате увеличения неспецифического компонента взаимодействия),В осуществлении способа используются БАВ, принимающие активное участие впроцессах адаптации и компенсации повреждения - кортикостероиды и простагландин Е 2 (ПГЕ 2)Способ осуществляется следующим образом,На 1 этапе определяют характеристикиэритроцитов и сыворотки интактных доноров. Эритроциты получают посредствомцентрифугирования интактных доноров.Эритроциты получают посредством центрифугирования стабилизированной крови ипомещают в 0,4 мл биологической жидкости(сыворотки, околоклеточной жидкости), полученной от интактных доноров, в которуювнесены меченые кортикостероиды и ПГЕ 2в концентрациях 10 -10 моль для ПГЕ 2 икортикостероиды и 10 -10 моль, Основное требование при проведении этогоэтапа - предварительное тестирование крови людей по системе АВО. Спустя 30 мининкубации этой смеси при 37 С эритроцитыотмывают от несвязанного лиганда на миллипоровых фильтрах. Фильтры высушиваюти радиометрируют в простом толуоловомсцинтилляторе, На основайии полученныхданных строят график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат)от концентрации внесенного в инкубационную среду (ось абсцисс).На построенном графике определяютместо перегиба, необходимость выявления"которого обусловлена тем, что этой точкесоответствует насыщение специфических кданному радиолиганду участков связывания. Дальнейшее связывание (после насыщения специфических участков)обусловлено неспецифическими процессами (липофильностью и гидрофобностьюБАВ), химическими и физическими свойствами мембраны.Таким образом, смещение точки перегиба свидетельствует об изменении концентрации данного БАВ в окружающей клеткусреде, которое вступает в конкуренцию смеченым аналогом за места специфического связывания, Полученная концентрация и превышающая ее на порядок в дальнейшем используются для оценки стадии стресс-реакции. Дополнительная концентрация (на 5 порядок большая) необходима для оценкинеспецифического связывания, которое в основном зависит от химического состава мембран, и:меняющегося под действием стресса.10 Эритроциты и сыворотку, исследованные на 1 этапе, сохраняют в течение 2-3 недель при 1-4 С и используют по мере необходимости на 2 этапе. Экспериментальным путем определено, что исследованные 15 показатели при хранении в этих условиях втечение 3 недель не изменяются.Проведением 1 этапа(определение концентрации радиолиганда) достигается существенное повышение точности оценки 20 стресс-реакции благодаря исключению погрешностей; связанных с индивидуальными особенностями доноров и качеством использованных в работе реактивов.На 2 этапе готовят 2 серии инкубацион ных культур:1 серия - эритроциты здоровых доноров(заготовлены на 1 этапе), биологическая жидкость обследуемых;2 серия - эритроциты обследуемых, би ологическая жидкость здоровых доноров(заготовлена на 1 этапе).В каждой серии исследуется связывание с эритроцитами меченых ПГЕ 2 и корти- зола (кортикостерона у лабораторных 35 животных, что обусловлено особенностямиих эндокринной регуляции) в концентраци-ях, определенных на 1 этапе, которые добавляются в среде перед внесением эритроцитов. Режимы инкубации и последу ющей радиометрии аналогичны 1 этапу. Наосновании пОлученйых данных рассчитывают отношение приращений связывания лигандов в 1 и 2 сериях по отношению приращений связывания лигандов, пол ученных на 1 этапе(эритроциты и сывороткаинтактных доноров). При возрастании концентрации меченого БАВ, в среде инкубации на порядок определяют разницу отношений приращений для двух концент раций в 1 и 2 сериях, Выявляют вещество,для которого эта величина окажется наименьшей, и на основании этого производят оценку стадии стресс-реакции. Выполнение подобной процедуры приводит к некоторо му загрублению метода, однако подобныйподход оправдан, так как позволяет снизить влияние случайных факторов на результат,что ведет к повышению точности способаСпособ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1, Возраст обследуемых от20 до 50 лет. По предлагаемому способуобследовано 120 рабочих. " -5Первый этап исследования. Кров здоровых доноров получали со станции переливания крови. Полученную кровь тестировалипо системе АБО и резус-фактору, Эритроциты из цельной крови получали центрифугированиеми (3,5 тыс. об/мин,15 мин), дваждыотмывали раствором Хенкса притех.же ре-"кимах центрифугирования, Отмытые эрит-роциты сспендировалй в растворе Хенксапо 25 10 клеток в 50 мкл среды, заливали 15их в пластмассовйе трубы и для хранейияпомещалй в холодильник при 1-4 С,Сыворотку крови от здоровых донбровфильтровали через миллипоровые фильтрыс величиной пор 220 нм и помещали в пластмассбвь е трубы в холодильник при 1-4 С,. На 1 этапесыворотку крови здоровыхдоноров в объеме 400 мкл помещали в полистироловые-платы, в которые вносйли меченные по тритию и углеродулиганды(5, 256, 8, 11, 12; 14, 15 зН-простагландин Е 2 фйрмы Амершам, молярная активность - 6,48ТБк/ммоль) в объеме 50 мкл физраствбра доконечных Концентраций 500 мкл инкубационнойсреды"1011,2 1011,4 10 ,8 1011, 3010 , 2 10",410, 8 10", 10 моль и4" С-кортизол (молярная активность 1,8ТБк/моль, СССР) в объеме 50 мкл до конечных концентраций 10, 2 10 э 4 10 ", 810 1 О, 10, 210 , 4 10 , 8 10 , 10 д моль 35по три пробы каждой концентрации,Процедураразведенйя" на примере разведения ПГЕ 2,Удельная радиоак 1 ивность ПГЕ 2 по пас-.портусоставляет 6,48 ТБк/ммоль, объемная радиоактивность флакона по паспорту3,7 МБк/мл. Радиоактивность фасовки1,85 М Б к. Следовательно, для вычисленияобьема растворителя, в котором поставляется ПГЕ 2, необходимо общую активностьфасовки разделитьна объемную радиоактивность (1,85 МБк;3, 7 МБк/мл=0,5 мл или500 мкл). Для определения количества ве- щества, находящегося в фасовке, общую радиоаКтивность фасовки разделяют на 50удельную радиоактивность. йешбества (1 Я 5 МБк:6,48 ТБк/ммоль=0,28510 ммоль.или 0,285 10 моль),Такйм образом; имеется 0,285 10моль ПГЕ 2, растворенного в 500 мкл абсолютного этанола (растворитель поставки), Необходимо в инкубационной средес общимобъемом 0,5 мл созать концентрацию ПГЕ 2 10моль (примр), 6 онцентрация 10 Мсоответствует 10М в 1 мл или 0,5 10в 0,5 мл, Для решения атой пропорции 0,510М х 500 мкл: 0,285 10 М=8,75 мкл, Следовательно, 0,5 10 М ПГЕ 2 содержится в 8,75 10 мкл. Необходимо взять 87 5 мкл и развести в 10 раз. Разь бдение осуществляется поэтапно, На 1 этапе 8,75 мкл исходного раствора "разводят 500,0 мкл физраствора, 50 мкл полученного раствора разводят в 0,450 мл физраствора (разведение в 100 раз), При разведении 50 мкл последнего раствора в 450 мкл среды получают конецную концентрацию (разведение в 10 раз) в инкубационной среде, содержацгй сыороу, эритроциты и ПГЕ 2.По той же схеме рассчитывают другие концентрации.Радиоактивность полученных концентраций рассчитывают по формуле: количество вещества, умноженное на уд, радиоактивность вещества (0,5 10 х 6,48 х 10 Бк/моль=32,4 Бк), Следуетотметить что 10моль вещества соответствует 10 (число Авогардо)х 10= 10 молекул; таким образом, в 0,5 мл инкубационной среды сконцентрацией ПГЕ 2 10 моль содержится 10 молекул ПГЕ 2.Расчет радиоактивности используют при проведении очистки ПГЕ 2 на колонке, заполненной кремниевой кислотой (БИР РЕД, США), смесью 0,04 обьемных долей метанола и 0,96 обьемных долей хлороформа с последующим упариванием и разведением в абсолютном этаноле. В последнем случае пересчитывают на выход с колонки (65% - х 0,65).В каждую ячейку платы заливают 25 10 эритроцитов (к уже залитым сыворотке и меченому лиганду в объеме 50 мкл и помещают в термостат при 37 С,После инкубации клетки осаждают на миллипоровье фильтры (450 нм) и отмывают 25-кратными о 5 ьемами физраствора, содержащего немеченые лиганды (десятикратно превьшающие по концентрации использованные). Фильтры высушивают и радиометрируют в простом толуоловом сцинтиллятаре на сцинтилляционном счет- цике Бета(эффективность счета по Н -з 57,5%, по С - 97%).Данные представлены в табл,1.На основании таблицы строили график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат) от концентрации, внесенной в среду инкубации (ось абсцисс) для донора С., 28 лет, Ш гр. крови, резус+,На построенном графике определяли место перегиба(для ПГЕ 2 - 0,9 10 М, для кортизола - 10 М).17834408Полученные таким образом результаты инкубации с сывороткой донора П. По отноявляются контрольными для обследуемых, шению к прираще ПГЕ. имеющих группу крови 1 И и резус+, эритроцитами донора С, при их инкубации сНа 2 этапе исследования у обследуемых сывороткой донора С. (Хо/Хконтр).также получали эритроциты крови (3-кратнойотмывкойцентрифугированием 3,5 тыс. Хопыт 736-585,51об/мин 15 мин), стабилиэированнои гепа Х 737 1 - 592 4рином или цитратом венозной крови, и сыворотку (отстаиванием при 4 С в течение 2 (см. табл,1)ч и последующим центрифугированием 3,5 10 где 1,04 - отношенйе приращений связывэтыс.об/мин, 15 мин) нестабилйзированнойния кортизола с и бвенозной крови,ния кортизола с эритроцитами обследуемого П. при инкубации в сыворотке донора С.Полученную от пациентов кровь тести- по отношении отношению к приращению связыванияртизола с ритроцитами донора С. при ихровали по системе АВО и по наличию в кро- кортизола с,зрит ц С.ви резус-фактора. При определении И 15 инкубацииссывороткойдонора С,группы крови и резуса+ использовали для Как следует из полученных данных, внаи ольшеи степени изменяется свяэывапроведения реакции эритроциты и сыворот- наибольшей стку здорового донора С. Кровь обследуемых , ние МГЕ 2; поэтому, с целью повышения дос иной группой исследовали с эритроцитами стоверности "анализи сывороткой здоровых доноров соответст данным изменения связыввующей группы крови.менения связывания кортизола.Достоверные отличия связывания кор. Сыворотку крови рабочего й,(26 лет, тизола получены при инкубации эритроцистаж работы 1 год, оператор), имеющего Ш тов донора С. с сывор т й б Па, . с сыворотко раоочего Пгруппу крови и резус + в объеме 0,4 мл, (отношениеприращенийменее 0,63);следотка о следуемого . оказаливали в 12 ячеек пластиковых плат(объ вателъно, сыворотка обс е - П.ем ячейки 1,5 мл) и приливали меченый ПГЕ 2 . эывает ингибирующее ейв кон ент э иях опц р ц, пределенных на 1 этапе связывание меченого кортиэола, что обусующее де ствие на(0,9 10 - точка перегиба и 0,9 10 - в 10 ловлено избытком немеченоз ытком немеченого кортизола враз большая), в 6 ячеек и меченый кортизол сыворотке П. Возрастание концентрации( 09 и 10моль) в 6 ячеек по 3 на каждую 30 кортизола в сыворотке характерно для наконцентрацию чальной стадии стресс-реакции.В следующие.12 ячеек заливали сыво- Таким образом, обследуемый П. нахоротку здорового донора С., в которые анало-дится в начальной стадии стресс-реакции.гичным образом и в тех же концентрациях . На основании проведенных исследор ливали меченые лиганды (но 3 на каж ний составлена диагностическая бвэдую концент ацию),.ская та лица,ду ц н рацию),. использование которой значительно упроЛолистироловые платы разогревали в щаетдиагностическуюпроцедуру(табл.3),термостате втечение 5 мин(37 С) ив заполненные ячейки вносили эритроциты; в сыво- производство. слесарь КИП, стаж работы 3ротку крови обследуемого П, - по 25 10 40 года,клеток здорового донора С, в объеме 50 мкл2 пациент, П 38 лет, оператор, стажи в сыворотку крови здорового донора С. - работы 3 года,25 106 эритроцитов обследуемого П. (50 . 3 пациент С 24 года, оператор, стажмкл), работы 4 года.После 30-минутной инкубации при 37 С 45 Результаты представлены в табл.4,эритроциты осаждали на фильтры с величи- Как следует из данных, полученных приной пор 450 нм, отмывали 25-кратным исследовании по заявляемому способу 1 паобъемом физиологического раствора, со- циента (К), наименьшей разницей отношедержащим в избытке немеченые лиганды ний приращений связывания обладаетФильтры подсушивали и помещали в специ меченый ПГЕ 2; следовательно, для повышеальные контейнеры, вкоторых доставляли в ния точности диагностики стадии стресс-релабораторию СГМИ, где радиометрировэли акции целесообразно использовать данные,.на счетчике БЕТА. На основании получен- полученные при инкубации эритроцитов сных данных составлена табл.2, ПГЕ 2, Во всех случаях отношение приращеПример расчета по данным рабочего П.; 55 ний связывания находится в пределах 0,63 Ходыт 701,1 662,2 041,37. Следовательно, стресс-реакцияХконтроль 740 - 643,0 отсутствуетгде 0,4 - отношение приращений связыва- При обследовании пациента К. по прония ПГЕ 2 с эритроцитами донора С, при тотипу обнаружено значительное (на 48)П р и м е р 3. В эксперименте использо-,вали мышей линии СВА в количестве 405 (самцы, возраст 5-6 месяцев, масса 18-22 г).В ходе эксперимента животных разделяли на 2 группы, у одной из которых вызывали развитие стресс-реакции путемобездвиживания в плексиглазовых трубах в0 течение 8 ч, другую содержали в обычныхусловиях (по 20 животных в каждой группе).В ходе эксперимента использовали методслепого контроля, состоящий в том, что доконца исследования принадлежность живо 5 тного к той или иной группе была неизвестна,В связи с выполнением экспериментана животных в методику исследований быливнесены следующие изменения:1) получение крови и сыворотки производили декапитацией животных;2) групповая совместимость крови неоценивалась, так как была обеспечена генетической идентичностью линии животных,3) в исследовании вместо 14 С-кортизолэбыл использован Н-кортикостерон (1, 2 6,зН 4-кортикостерон, молярнэя активностьз2720 ТБк/моль), что связано с особенностью их нефроэндокринной регуляции.4. Для оценки концентрации ферментовбыли использованы методические приемы,позволяющие исследовать активность ферментов в микроколичествах крови.5, Количество добавляемой в платы сыворотки составляло 100 мкл, а меченые лиганды вносились в объеме 10 мкл.6. Ввиду малого количества сыворотки,получаемой от.животных, на 2 этапе исследования проводили в 2 повторностях, покаждой концентрации меченого БАВ,% увеличение кислой и щелочной фосфатаз, что, согласно прототипу, расценивается как наличие стресс-реакции. Противоречие диагностики нашло объяснение в том, что у обследуемого К, при клиническом и лабо раторном исследовании выявлен хронический, вялотекущий пиелонефрит, сопровождающийся нарастанием активности ферментов крови;При обследовании пациента П, наи меньшей разницей отношений приращений обладает кортиэол, поэтому анализировали связывание эритроцитами кортиэола. Изменение связывания кортизола с эритроцитами донора С. при их инкубации.с 15 сывороткой пациента П меньше порогового значения (0.63), в то же время изменение связывания кортиэола при инкубации эритроцитов пациента П. с сывороткой здорового донора С. не превышает пороговое 20 значение (1,37).Следовательно, пациент П. находится в стадии тревоги. Анализ активности ферментов по прототипу показал повышение активности ферментов на 16,3, что долж но рассматриваться как отсутствие стресс- реакции. Однако при клиническом обследовании данного пациента обнаружена анемия неясной этилогии (эритроциты - 3,6 Тлитр, гемоглобин - 92 Глитр), провале нием которой является снижение активности исследуемых ферментов.Анализ данных, полученных при исследовании крови пациента С,. продемонстрировал, что с.целью большей достоверности 3 следует иСпольэовать данные по связыва. нию ПУЕ 2; Оценка этих параметров показывает, что отношение приращений . связывания ПГЕ 2 с эритроцитами обследуемого С, при инкубации последних в интак тной сыворотке превышает порог 1,37, что свидетельствует о наличии повреждения клеточных мембран. Важно отметить, что у данного пациента при клиническом исследовании не выявлено соматической патоло гии, активность ферментов свидетельствует о наличии стресс-реакции (возрастание ак-: тивности на 61,2), Последнее совпадает. с данными, полученными по данному способу. Подтверждением адекватности диагно стики является то, что исследование проведено сразу после ликвидации аварийной ситуации, связанной с выбросом сернистого газа, и работы в средствах индивидуальной защиты (близкие показате ли в тот день были получены и у других пациентов).Следует отметить, что среди обследовэнныхлиц клинически выявлено в 52 случаев обострение хронических заболеваний или вновь возникших заболеваний, в пэтогенезе которых важное место занимает стресс-реакция (язвеннэя болезнь желудка и 12-перстной кишки, гипертоническая болезнь, астено-вегетативный синдром и др.). В эту группу вошло 32 человека, оцененных кэк находящихся в стадиях стресс-реакции, и 31 человек - в стадии покоя по методу, изложенному в прототипе. В то же время в данную группу (63 человека) вошло 60 чело-. век, у которых обнаружена та или иная стадия стресс-реакции, и 3 человека, состояние которых расценивалось, как состояние покоя по заявляемому способу. Таким образом, ошибочный диагноз по прототипу был вынесен в 31 случае, или в 49,2. По предлагаемому способу ошибочное заключение было сделано в 3 случаях, или в 4,7.Следовательно, повышение точности заявляемого способа по сравнению с прототипом составляет 44,5., Данные для поСтроения.кривой завичества везеств, внесенных:28 лет, 11 гр,крови, рез средних значениях по 3 пр с.еа,ваиае аива таееи МщвищииюМитии щю е щиищавЬйЪ аев ивищииаайщтииютивитав(РОСтаГЛаНДИН Ег, е -" " КОРтИЗОЛ ативМЧайМВииМаиКоличествокортизола,связанного с 25 10 " "эритроц 1 лтон""щ еев ввещ1 б,6", :,;,97,9 "251,441 4,6592,4646,8611,1 "720737,1е июв вю а еюва вс а ит е и и в и ю а т а а т е в юв в а и т а Гадиоактив"ность "свщяванной с2510 эрит 0РОЦИТОВ бв Л Концентрация в среде пмоль,(моль) Количество ПГЕг, свя" ванного с . .25 10 эритроциТов, Фноль Радиоактив" НОСТЬ СВЯ ванной с 25 1 О зрит"а роцитов ки, кБк Концентратция в средеепмоль(моль) ва и еаав тт щва иващвт ее100 (1 о м)2004 оо :8 оо1 ооо (10)20004 аоо8 оао1 оооа (1 о %) ва еа ееи е в0,0290,176-.0,452а,75 .1,071,161,091 291,32 .1",-",10 (10 )го408 о1 оо (1 о и)2004 ооОао1 ооо (1 ом) 0,15 0,81 2,15 3,34 4,17 4,36 4,53 4,69 4,79 23,3124,7331,1515643,5672,1699,8723,9740,3 е ааааае Мисю.: ю ю 1",ев;с,.е.рВйюч -"ю.7 сан , я .:Р,41- . юс; , ,".; . ;.1 с.И. Л 1+;.юа тю Г ", е;: ЛъФМ-,-ею:, ар ел л г; .Фу ущфффйсю а ,.Ы р На 1 этапе были определены рабочие концентрации меченых БАВ (ПГБ 2 и кортикостерона), которые для мышей линии СВА " составили 1,9 10 М, 1,9 109 М и 0,8 10 М соответственно,5Данные представлены в табл.5.Выбрав БАВ с наименьшей разницей отношений приращений, Которйм"Ьстаом и другом случае являетСя кортикоСтеросн,"и " сравнив отношенйя приращенийкбртико стерона в диагностической таблице, можно придти к заключению; что животйое В 17 находится в начальной стадии стресс-"реак- ции - в стадии тревоги, а животное Йг 28 - в стадии покоя. Между тем акстйвноесатье фер ментов,определенййх в соотвеатсбтвйис"прототипом; по"отНо"шению ккосетролю составило 16 и 14 О собтветствейело," что по-" " зволяет квалифицироевать"Йх саосТоянййкаюксостояние покоя, : " -" 2 ОРасшифровка протоколов покаазлаЛа, чтб животное М 17 отнОсится к группЕ сй 1 дсук-". цированной обездвикиванием стресс-реак- цией, животное чэ 28 - как интактное,Таким образом," йри диагйостйке состо яния животного К. 17 по методу,излокенному в прототипе, допущейа ошибка,"Анализ данных всего зксепервйме.та показал, что ошибочное решение приисполь-"фл эовании способа, взятого за прототип, принято в 18 О случаев, а при использованиипредлагаемого способа - в 5 случаев; следбваительйо" ,йовышаение точности оценки.стадйй стрессс-реаюЙции йо предлагаемому,способусоставляет.13 чтр, однако, существенноййм(е, чемпри обследовании людей. .Г 1 одобныи диссонанс .обьясняется темчто В тличиие "от обследовсаных людей вэксперименте использовалигенетическийдейтичньй, "заведомо здоровых, содержащихся в "одилаковых условиях лабораторных животных",что в реальной ситуации йри,обследоналйлийс людей практически исключеноФ о р му л а и зо б р е т е н и яСпоссб определения стресс-реакций,;вкочаощсий регИстрацию уровня биологи-,чески аектйвныхвеществ (БАВ) в,крови об-.следуемоегб; о т л и ч а и щ и й с.я тем, что,с цельюповышения точности способа, эрит-роциты доноров и обследуемого помещаютв биолеоегические жидкости обследуемого, вкоторые предварительно вносят меченыеБАВ; регистрируот уровень приращения .связывания БАВс эритроцитами обследуе- .мого, и при его значении менее 0,63 устанавливаот наллйчйе стресс-реакцииТ а б л,и ц а 1сйлостис связывеаййя ЛГЕ 2 и кортизола от коли"в среду инкубации (здоровыГл долор 0.,ус +), Радиоактивность представленаа в " "- "обам13 1783440 14 Табли ла 2Данные, полученные при обследовании рабочего П.по заявляемому способу г+сыворотка доноРа СФ Показателии херактеристики Эритроц. П,+сывоЭтироц.донораС.+сыво"роткаобслед,П. Ротка донора С. атее Ката0,910Фмоль/ 0910 10 уд кор 707,3 736,0ПГЕвг в 701,1 784,4 тизол в фмоль фмольФмоль фмоль(Ч) (Ч)приращение 38,9 приращение 86,82 150,49(Т-Т)-Хаяг (Т -Т)-Хприраз 1 еиме 97,3 приращение 144,7при тех же при тех жеконцентр. концентр,в контр в контрХкеер ХзекиГотнощение 0,40 135 отноиение 0,60приращем. лриращен.Хза/Хкев хаь /хкоыравмица 0,95 (1,33-0,4) разница 044 (1,04-0,6)приращем. приращен.о 2 и 3 во 5 и 6колонках колонкахтаблицм таблицыГавевавееает атееиеееиааиевавеввиеаегтегееетеаетв ее вагит а виватаеП р и м е ч а н и е: расчет отноаения прираЩений при возрастании концентрации метки в среде производили ло формулеХрьфсае Тт(ар.-Тзгде Х и приращение;Т - связывание при концентрации метки в средеинкубации, соотаотствукщей точке перегибау интактного донора;Т - связывание метки лри концентрации в средеинкубации, в 1 О раз больией 13136 1447 97,3 1,04 Таблица 3 Отношение приращений исследуемых показателей, полученных на этапе е: в том случае, когда отношен вания БАВ с эритроцитами 3 руемых в сыворотке обследу а отношение приращений св тами обследуемого, инкубир здоровых доноров, более 1,3 следует оценивать как перех к стадии повреждения клеточ приращений 0,63 и 1,37 полу статистического анализа по ных меченых лигандов у люд животных, заведомо находя или состоялу(я покоя, и соотв колебаний средней для норм Примеч ие приращений связыдоровых доноров, инкубиемого лица, менее 0,63, язывания БАВ с эритроциуемых в сыворотке 7, состояние обследуемого од от стадии тревогиных мембран, Порогичены на основании связыванию использован-, ей и лабораторных щихся в состоянии стресса етствуют размахам ы величины .ф. 38 ф(р 0,05),1783440 Таблица 4 Пациент М Эритроциты обследуемых в сыворотке донора С, ПГЕг ко тизол ПГЕг 0,97 ПГЕг1,11 кортизол . 0,68Разница отношений приращений для ПГЕг 0,14 (1,11- 0,97) Разни а отношений и ля ко тизола 0,63 131-068 0,53 0,61 1 36 1 25Разница отношений для ПГЕг 0,83 (1,36- 0,53)Разни а отношений и и а ений ля ко тизола 0,64 1,25 - 0,61 0,99 0,72 159 1,60 Таблица 5 Оценка стадии стресс-реакции по заявляемому способу и прототипу животных В 17 и К Отношенйе п и а ений связывания БАВ Животное МЭритроциты исследуемых, сыворотка интактных жив,х ПГЕг кортикосте он ПГЕг кортикосте он 1,361,19 1,36 1,20 0,52 0,51 0,47 0,43 17 28 Корректор М.Керецман Редактор Г,Бельская Заказ 4512 Тираж"ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4 Й Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Данные обследования 3 рабочих газоконденсатного завода,имеощих Ш группу крови и резус+, Представлены данные отношения приращений связывания БАВ к приращениям связывания, полученным при выполнении 1 этапа (эритроциты и сйворотка донора С).Эритроциты здорового донора С. в сыворотке обсле- емых Разница отношений приращений для ПГЕг 0,6 1,59-0,99) Разница отношений и и а ений ля ко тизола,88 1,6-0,71:Составитель О,МакеевТехред М.Морген 1 ал Активность ферментов в крови жив-х, о к контр.