Способ идентификации сортов сахарной свеклы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19 4 А 01 Н 1/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ВИДЕТЕЛЬСТ Н АВТОРЧИК ательский юзный на- растение, З.А, Бо- Гаврилюк ультурных4 - 589. имия к 6, с.58 чносв са 0 семян мешают ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) физиология и биохрастений. 1982, т. 14,1Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры.Цель изобретения - повышение то ти и надежности идентификации сорто харной свеклы.На фиг. 1 представлено 11 типов спектров глобулинов, выявленных у 3-сортов сахарной свеклы; на фиг. 2 - эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы.Способ осушествляется следуюшим образом,У изучаемого сорта отбирают 10 без околоплодника, Каждое семя по 4) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОРТОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЪ(57) Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры. Цель изобретения - повышение точности и надежности идентификации. Отбирают семена без околоплодника. Каждое семя помешают в пробирку и экстрагируют суммарные белки. Затем из белкового экстракта методом криопреципитации выделяют глобулины, которые фракционируют с помошью электрофореза.Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегируюших агента (1% додецилсульфата натрия и 5% 2-меркапто- Я этаиола), и элевтрофореэ осушествлиют в вертикальных пластинах. 2 ил., 6 табл. в пробирку, тщательно раздавливают его стеклянной палочкой и заливают 0,2 м 1 М МаС для экстракции суммарных белков (альбуминов и глобулинов), которую проводят в течении ночи (15 в 16 ч). Затем глобулины осаждают из суммарного белкового экстракта охлажденной дистиллированной водой (методом криопреципитации).Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегируюших агента: 1%-ный додецилсульфат натрия и 5%-ный 2-меркаптоэтанол. Полученные глобулины фракционируют с помошью электрофореза. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.Глобулины диссоциируют до полипептидов в нагретом до 100 С 0,25 М трис-НС 1буфере (рН 6, 8), содержащем 1 О/О-ный додецилсульфат натрия и 5/О-ный 2-меркапТоэтанол. Продолжительность электрофореа 3 ч при силе тока 50 мА на пластину и апряжении 200 В. Электрофорез осущестляют в вертикальных пластинах.В табл, 1 - 3 приведены данные результатов испытания режимов экстракции и электрофоретического фракционирования глобулинов, позволивших получить четкие и многокомпонентные спектры.В табл. 1 приведены результаты изучения ,электрофоретических спектров, полученных ,при фракционировании глобулинов семян сахарной свеклы с околоплодником и без него.Как видно из приведенных данных, использование для экстракции глобулинов семян без околоплодника позволяет получать электрофоретические спектры более четкие и с большим числом компонентов, чем для глобулинов семян с околоплодником.В табл. 2 показано влияние условий экстрагирования и продолжительности электро,форетического фракционирования на полноту извлечения компонентов глобулинов из ,семян сахарной свеклы сорта Белоцерковская односеменная 34.Из приведенных данных видно что обьем экстрагирующего буфера 0,1 мл не достаточен для проявления субъединиц глобулинов с К 0,02, 0,10, 0,18, 0,21, 0,26, 0,35, 0,75. Объем - 0,3 мл - великоват, поэтому на электрофоретических спектрах зоны с К 0,42 и 0,64 плохо разделяются. Вместе с темпри использовании для экстрагирования бел ков 0,2 мл буфера были получены четкие электрофоретические спектры с 23 компонентам и.Из табл. 2 видно также, как влияет продолжительность экстракции на качество получаем ых электрофоретических спектров. Часовая и трехчасовая экстрации не достаточны для извлечения из одного семени всех субъединиц глобулинов. Только экстрагирование белков в течение ночи (15 в 16 ч) обеспечило получение электрофоретических спектров с наибольшим числом компонентов (23).При трехчасовой (сокращенной) продолжительности электрофореза получен электрофоретический спектр с 23 компонентами. При продолжительности разгонки 7 ч часть субъединиц глобулинов свеклы (К 1 0,73, 0,76, 0,78, 0,82, 0,87, 0,92, 0,96) выходит из геля.Следовательно, наибольшее число компонентов в спектрах обнаружено при использовании объема экстрагирующего буфера 0,2 мл, продолжительности экстракции на ночь, продолжительности электрофореза 3 ч.В табл. 3 представлены результаты сравнения электрофоретических спектров глобулинов, описанных известным и предлагаемым способами. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хак видно из табл. 3 электрофоретические спектры суммарных белков в нативной системе геля имеют в своем составе только 6 компонентов глобулинов: три из них основные (К( 0,13, 0,20, 0,28), а три минорные (К 0,03, 0,09, 0,48). Применение одного дезагрегирующего агента (ЗРЯ) повышает разрешающую способность фракционирования глобулинов (12 компонентов). Но она все же недостаточна. Введение двух дезагрегируюших агентов - Ю 8 и 2-меркаптоэтанола - значительно улучшает электрофоретическое фракционирование и позволяет получить четкое разделение 23 субъединиц глобулинов.Предлагаемым способом изучено три сорта сахарной свеклы: Белоцерковская односеменная 45 (БЦ 45), Веселоподолянская 29 (ВП 29), Индустриальная. В каждом сорте проанализировано от 100 до 150 семян. При этом выявлено 11 типов спектров глобулинов (фиг, 1), которые различаются числом компонентов в спектре, интенсивностью окраски и относительной электрофоретичес кой подвижностью некоторых ком. понентов.Полученные электрофоретические спектры изучаемого сорта (100 спектров) записывают в виде белковых формул при сравнении их с эталонным электрофоретическим спектром глобулинов сахарной свеклы. Эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы представлен на фиг, 2, его белковая формула,с. 123 р (1)23456 у 12345678910 % 123(4) 56789.В табл. 4 представлены белковые формулы 11 типов спектров, обнаруженных у трех сортов сахарной свеклы.Записанные в виде белковых формул электрофоретические спектры глобулинов отдельных семян разделяют на группы по типам спектров и определяют частоту их встречаемости для каждого сорта в данной выборке семян.Спектры изученных сортов сахарной свеклы приведены в табл. 5.Как видно из табл. 5, сорт БЦ 45 имеет следующие типы спектров: 3, 4, 6, 7, 8, 9, О, 11; сорт ВП 29 - спектры 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, а сорт Индустриальный - спектры 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Некоторые типы спектров оонаружены только у сорта Белоцерковской селекции - 9, 10, 1, а спектры 1, 2, 5 - только у сортов ВП 29 и Индустриальный. Из данных табл. 5 видно также что каждый сорт характеризуется неодинаковым распределением частот встречаем ости основных типов спектров. Так, наиболее часто встречаемым спектром у сорта БЦ 45 является спектр 9 (35, 60/о), а наиболее редко встречаемым - спектр 6 (4, 40 О/о), который однако у сорта ВП 29 встречается чаще других (32,30 О/о). Для сорта Индустри1463190 альный наиболее часто встречаемым является спектр 1 (26, 60%).Таким . образом, каждый сорт отличается от другого не только наличием разных типов спектров, но и частотой их встречаемости. При этом каждый сорт имеет наиболее характерный для него тип спектра (наиболее часто встречаемый). Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что различия между сортами достоверны - НСР 0,05 = 0,136. Формула изобретения Такая характеристика сорта может быть наглядно представлена в сортовой решетке, В верхней графе этой решетки указаны характерные для данного сорта типы спект ров, а в нижней - частота их встречаемости в процентах (табл. 6).Применение предлагаемого способа в селекции сахарной свеклы дает возможность четко идентифицировать сорта по частоте Показатели Электрофоретические спектры глобулинов семян сорта Белоцерковская односеменная 34 Без околоплодника С околоплодником 16 23 Диффузное проявление6 компонентов Четкое проявлениевсех компонентов Таблица 2 Объем экстрагирующего буФера,Показатели0,1 0,2 0,3 1 3 Ночь 3 4 7 Число электрофоретических компонентов 23 21 17 18 23 21 16 19 23 0,02 -- 0,02 0,10 О, 10 -- О, 10 О, 18 0,87 О, 73 0,92 0,76 0,96 0,78 Не проявляющиесякомпоненты (КГ) 0,18 -- 0,18 0,82 021 -- 023 026 О 26 -- О 26 0,87 0,92 0,35 -- 0,37 0,70 0,96 0,75 Число электрофоретическихкомпонентов Четкость электрофоретических компонентов встречаемости электрофоретических спектров глобулинов в выборке 100 семян, Способ позволяет наряду с идентификацией изучать генетическую структуру популяции, определять оригинальность и константность сорта. Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включающий электрофорез белковой вытяжки семян без околоплодника и последующий анализ полученных электрофоретических спектров, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и надежности идентификации, электрофорезу подвергают глобулины отдельного семени, которые выделяют методом криопреципитации, при этом перед электрофорезом в белковую вытяжку вводят два дезагрегирующих агента - додецилсульфат натрия и 2-меркаптоэтанол.Таблица 1 Продолжительность Продолжительностьэкстракции, ч электрофореза, ч1463190 Продолжение табл. 2 Показатели Объем экстрагирующего буфера,Продолжительностьэкстракции, ч Продолжительностьэлектрофореза, чщ0,1 0,2 0,3 1 3 Ночь 3Не разделившиесязоны (ВХ) 0,42 0,64 0,64 Таблица 3 Компонен Относительная электрофоретическая подвижностькомпонентов глобулинов в электрофоретическихспектрах (КК) Нативная система геля -известныйспособ 0,02 0,02 0,03 0,10 0,30 0,09 0,18 0,32 0,13 0,36 0,22 0,20 0,24 0,28 0,39 0,48 0,28 0,54 0,34 0,59 0,40 0,80 0,83 0,42 0,46 10 0,88 0,48 0,93 0,52 12 0,95 13 0,54 0,58 0,62 0,68 16 0,70 18 0,73 19 0,76 С применением одного дезагрегирующего агента (БОБ) опробованное решение С применением двух дезагрегирующих агентов (БОБ и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ1463190 10 Продолжение табл. 3 Относительная электрофоретическая подвижностькомпонентов глобулинов в электрофоретическихспектрах (КЕ) Компонен С применениемодного деэагрегирующего агента (808)опробованноерешение Нативная система геля -известныйспособ 20 0,78 21 0,82 22 0,87 23 0,94 Общее число компо- нентов 12 23 Таблица 4 Основные типы электрофоретических спектров глобулинов трех сортов сахарной свеклы (белковые формулы)(2)4569 С применением двух дезагрегируюших агентов (БОБ и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ1463190,Таблица 5 Частота встречаемости типов спектрасортопопуляции Тип Сортфактор А спектраФакторВ 11 повСреднее торность 1 повторность-6,11 -2,45 2,20 1,80 2,60 2,00 2,27 7,65 13, 70 17,70 13,40 13,00 16,504,40 0,04 17,174,46 2,75 5,00 13,60 35,30 13,00 26,20 19,40 12,70 13,30 35,60 13,30 26,67 20,00 13,37 Эффекты уровней факторови эФфекты вза"имодействий1463190 14 13 Продолжение табл. 5 Тип Сортфактор А спект 11 повСреднее торность 1 повторность 0,00 2,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 10 0,00 0,00 0,00 П р и м е ч а н и е, НСР 0,05 для сравнения частных средних 0,136. Таблица 6 Спектр(сорт БЦ 45) 3 10 8 9 4 6 7 Частота 15,57 6,70 4,40 4,40 13,30 35,60 13,30 6,77 встречаемости,рафакторВ Частота встречаемости типов спектрасортопопуляции Эффекты уровней факторови эффекты взаимодействий1463190 б,10 О,Я 022 О,Г 4 П,Г 8 Щ, Г Составитель :. Шк Техред И. Верес Тираж 6 8 тета по изобретениям Ж - 35, Раушская комбинат Патент, гад Редактор В. ДанкоЗаказ 62/3НИИПИ Государственного ком113035, МосквПроизводственно-издательский Рома ненко Г НТ ССС Корректор В.Подписноеоткрытиям при Кнаб., д. 4/5Ужгород, ул. Гагарина,057 040 7,4 Г ОФЕ ао 7,5 Е 05 а,в Я - ОЯ ( 70 б,75 0,76 0 7 о ОЫ 087 О,И О,Уб 7 Г ,У Ф 5 8 7 8 У 70 7 у