Способ идентификации сортов сахарной свеклы

(5)5 А 01 Н 1/04 ГОСУДРРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им.А,Л.Маэлумова(56) Лесневич Л.А., Болелова З.А. Оценка иизучение генофонда свеклы по белкам-маркерам, - С/х биология, 1987. В 4, с. 58 - 63. Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к биохимическим методам сортовой идентификации,Цель изобретения - повышение точности определения,Способ состоит в том, что после электрофореэа анализу подвергают функциональные белки-ферменты отдельного семени, а затем на основе злектрофоретических спектров подсчитывают частоты встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которым судят об идентичности или отличии исследуемых сортов.Способ осуществляют следующим образом.Определяют идентичность или отличие семян различных сортов.Для анализа берут выборки в 50-100 семян исследуемых сортов. Размер выборки обусловлен использованием критерия Х при математической обработке полученных данных.Семена освобождают иэ околоплодников, измельчают на предметном стекле в кап,е Беппо 1672999 А 1(54) СПОСОБ ИДЕНТ ИФИКАЦИИ СОРТОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству. а именно к биохимическим методам сортовой идентификации. Цель изобретения - повышение точности определения, Способ состоит в том. что проводят электрофоретический анализ функциональных белков-Ферментов, на его основе подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которой судят об идентичности или отличии исследуемых сортов, 6 табл.ле воды или буфере. В полученной суспензии смачивают кусочек хроматографической бумаги "Ватман 3 мм" размером Зх 5 мм, который затем вставляют в стартовую щель гелевого блока для электрофореза. Гелевый блок готовят из гидролиэованного крахма- а ла.осСпособ приГотовления гидролизованного крахмала следующий.Промышленный пищевой картофельный крахмал в количестве 250 г помещают в 0 литровую широкогорлую колбу и ставят в О термостат при 37 С. Отдельно готовят под- О кисленный раствор ацетона, Для этого в пол-литровую бутыль. содержащую 0,5 л ацетона, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (ОСЧ), закрывают пробкой и ставят в термостат при 37 С. После того, как крахмал и ацетон прогреваются до 37 С, реакцию гидролиза запускают, выливая подкисленный ацетон в крахмал. Время гидролиза крахмала 15 мин, Останавливают гидролиэ добавлением 250 мл 1 М раствора ацетата натрия. Каждый образец5 10 15 20 превышает 1. да сравнивваотам встречваО, когдамеют ни однох случаях поромежуточное ель г сходства одства популяовать как часаемых сортах, ий идентично 5 0 емян во втором со 40 45 крахмала с определенным временем гидро- лиза тщательно обмывают на воронке Бюхнера десятикратным количеством дистиллированной воды, после чего осушают его на воронке ацетоном (100 мл), затем раскладывают на лист фильтровальной бумаги и сушат при комнатной температуре. Первоначальную оценку крахмала проводят по качеству приготовленного из негогеля, Для приготовления геля берут 20 ггидролизованного крахмала, 20 г сахарозыи 140 мл 0.75 М трис-цитратного буфера, рН7,0, гелевого буфера и помещают в колбуобъемом 500 мл, Смесь разогревают наэлектроплитке или газовой горелке при непрерывном помешивании. Если время гидролиза подобрано правильно, то растворкрахмала при нагревании сначала загусте.вает, а при дальнейшем нагревании раэжижается и начинает кипеть с большимколичеством мелких пузырьков воздуха,Нагревание продолжают до появлениякрупных редких пузырьков воздуха, послечего нагревание прекращают. В нормальном хорошем крахмале пузырьки воздухасразу исчезают и раствор становится прозрачным,Горячий раствор крахмала заливают вкювету, в которой он полимериэуется в течение 1,5 - 2 ч. Полностью эаполимеризовавшийся гель должен быть достаточнопрочным и эластичным.Гель в заправленной кювете имеет центральную горизонтальную часть, котораяпереходит, не прерываясь, в две боковыевертикальные части, предназначенные длянепосредственного контакта геля с электродным буфером, Перед нанесением образцов гель охлаждают в холодильнике до2 - 4 С, не допуская его замораживания,Для электрофореэа используют трисцитратную буферную систему. Электродный буфер 0,1 М трис-цитратный, рН 7,0,Целесообразно использовать в одном приборе ферменты с близкой электрофоретической подвижностью, что позволяетиспользовать гелевый блок соответствующего размера и, следовательно, экономитьматериал и время,После окончания электрофореза гельизвлекают из кюветы, разрезают на пластинки толщиной 1,5 мм и окрашивают насоответствующие ферменты (табл.1).В среду для малик-фермента добавляют2 мг М 9 Сг.Пластины геля инкубируют при 37 С дочеткого проявления, Затем зимограммыпромывают водой, зарисовывают или фотографируют спектры изоферментов,Зимограммы фиксируют в смеси глицерин - вода(4:10) втечение сут при 4 С, затем покрывают с обеих сторон листками целлофана и высушивают, Высушенные пластины хранят длительное время в темноте, в сухом месте.На электрофореграммах получают спектры ферментов разной подвижности. Даава подсчитывают количество семян с каждым вариантом генотипа по данному ферменту в общей выборке и определяют частоту встречаемости генотипов, Например, сравнивают два сорта Белоцерковская одн, 34 и Рамонская одн, 32 по малик-ферменту (табл,2).Показатель г сходства этих двух популяций выч рмуле0,521 0,527 0,20 +9521 Оли ОввЗначение показателя г не Оно равно 1 в тех случаях, Ког мые сорта идентичны по част мости. Показатель г сравниваемые популяции не и го общего аллеля. В остальн казатель г сходства имеет и значение между 0 и 1. Показа является мерой попарного сх ций. Его можно интерпретир тоту общих аллелей в сравнивПосле вычисляют критер сти 8 М 1 Йг (1 - 2) М 1+ Иг где М 1 - общая выборка семян в первсорте;гчг - выборка с рте. Величина распределена так же, как и Х, если превышает табличное значение Х с заданным уровнем значимости, то между выборками есть различие, Х табл. = 5,991 при уровне значимости Р - 0,056. И таким образом сравнивают все сорта друг с другом и по всем трем ферментным локусам.По результатам математической обработки судят об отличии или сходстве сравниваемых сортов по частотам встречаемости изоферментн ых локусов.Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. По указанной выше методике проводят анализы и последующую математическую обработку. Результаты представлены в табл.3. Идентификацию1672999 Таблица 1 Состав инкубационных смесей для различных ферментов Фермент 0,1 Мтрис.- НС 1, рН 8, 9 НАД,Субстрат,млО,Э МДГ НСТ НАД НАФ ФМС егидрогеназ ос ат аблица равнение сортов свеклы по малик-ферменту сортов ведут путем сравнения частот встречаемости изоферментных локусов по величине критерия идентичности (Х табл, = 5,99),гТак как (58,76)Х табл,(5,99) по Моб -1, то по другим локусам проводить анализ 5 (сравнение) нет смысла, сорта уже различаются.П р и м е р 2. Все приемы аналогичны примеру 1, сравнивают другие сорта свеклы. Результаты представлены в табл.4. 10По локусу Мод - 1 различий не обнаруживается. так как (089) Х табл (5,99), поэтому необходимо сравнение по следующему ферменту (Мог). В данном случае (10,04)Х табл, т.е. сорта различа ются, сравнение по третьему ферменту не обязательно.П р и м е р 3, Все приемы проеодят аналогично примеру 1. Результаты представлены в табл.5, 20По локусам Моб - 1 и Мог - 1 различий нет, Необходимо сравнение по третьему локусу, В данном случае 1(78,0)Х табл., т,е.гсорта различаются по третьему локусу (изоферменту), При увеличении числа сравнива- малатдегидрогеназа, ГД - глутамат - нитросиний тетразолий- никотинамидадениндинуклеотидД - никотинамидадениндинуклеотид - енаэинметас льфат емых сортов может быть увеличено число изоферментов.В табл,6 представлены показатели сходства и различия сортов сахарной свеклы по изоферментным локусам (значения критерия идентичности).Настоящий способ достаточно точно позволяет устанавливать сходство или различие исследуемых сортов сахарной свеклы. Формула изобретения Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включающий электрофореэ экстрагированных белков семян и анализ полученных электрофоретических белковых спектров с установлением идентичности или отличия исследуемых сортов, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения.анализу подвергают спектры функциональных белков-ферментов, подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которой судят об идентичности или отличии сортов.1672999 Таблица 3 Сравнительный анализ сортов свеклы Киргизская одн, 25 и Межотненская 070 Значение к ите ияСравниваемые сорта Моб - 1 Мог - 1 Киргизская одн, 25 Мекотненская 070 58,76 Таблица 4 Сравнение сортов свеклы Ялтушковская одн. и Белоцерковская одн. 34 Значение критерияМог - 1Сравниваемые сорта Мод - 1 ООЬ - 1 Ялтушковская одн,Белоцерковская о н.3410,04 089 Таблица 5 Сравнение сортов Рамонская одн, 32 и Белоцерковская одн. 34 Значение к ите ияМог - 1Сравниваемые сорта Мод - 1 Сбп -1 Рамонская одн. 32 Белоцерковская о н.342,39 2,52 78,96 Таблица 6Показатель сходства нли различия сортов сахарной свеклыпо изоферментным локусам (значение критерия идентичности) одн, 32 одн,По малик-ферменту Белоцерковская одн.34 2,39 0,89 20,97 23,74 5,42 10,99 31,20 0,44 34,57 6,01 4,26 Ялтушковскаяодн. 29,57 40,21 4,64 6,04 Межотненская070 35,88 45,16 58,76 34,15 62,36 ВерхнячскаяО/2 5,47 Названиясортов Рамонскаяодн.32 Рамонская036 Рамон- Ялхущская ковская Межотнен- Рамонская 070 ская036 Верхняч- Киргиз- Североская 072 ская Кавказодн,25 ская одн,42/8)96 25,92 0)98 88,02 73,20 43, 13 О;ВО 2,40 52,27 49,17 88, 13 0,80 Ялтушковскаяод. 66, 76 52,02 85,38 117,79 4,45 Межотненская 28,97 31,38 0,26 4,64 070 45,47 7,62 48,89 Верхнячская072 43,13 8,12 Киргизскаяодн.25 7,12 По малатдегидрогеназе Белоцерковская одн.34 2,52 10,04 29,75 29,56 3,57 19,57 41,35 15,88 29,92 3,32 2)07 5,10 11, 96 Ялтушковскаяодн. 6,38 18,01Заказ 2867 Тираж 358 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Названиясортов Рамонскаяод.32 Рамонская036 Рамонскаяодн.32 Рамонская036 Рамонская036 Северо- Кавказская одн.42