Способ получения арилламинариолигозидов

СОКИ СОВЕТСКИХСОЦИДЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 13474 Р 19/12; С 19 НИЕ ИЗ ЕНИ ЬСТВ кова 1 з в рН 5,2 дующим и полу 2. Способ по и щий ся тем, ч при концентрации15-20 мгlмл и ар 30 мг/мл реакцион ности фермента 0 ционной смеси. чаведутна,отл то процесс ф,3-глюк илглюкозиданой смеси и 75-1,5 Е/ип кти еак ЭЫ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ двтмснсвв сещател(71) Тихоокеанский институт биоорганическрй химии Дальневосточного научного центра АН СССР: ргорегй 1 ез оЮ 1 Ь -1,3-91 цсапцсапо, Ьу 4 го 1 азе Ггса Фе сгуИа 111 пе зйу 1 еоГ Ьча 1 ч 1 а вр 1 вц 1 а аасЬа 11 пепыз",ВВА, 1970, 212, 111.-115.(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРИЛЛАИИНАРИОЛИГОЗИДОВ общей формулыев,оя где й - глюкоза, ламинарибиоза,ламинаритриоза,ламинаритетраоза;Аг - арил, выбранный из группы,включающей п-нитрофенил,нафтил, о-нитрофенил,фенил, 4-метилумбеллиферил,отличающийся тем,что,сцелью упрощения процесса, смесь1 Ъ,3-глюкана и арилглюкозида, гдеарил имеет указанные значения, подвергают воздействию эндо-р .1,3-глюканазы из Ярцзц 1 а ьасЬа 11 пепв0,05 И буферном растворе при5,4 в течение 4-24 ч с послехроматографическим разделение1013474 Я час фиа 11 час фиг. Ю Составитель О. СкородумоваТехред О.Неце Корректор М. Демчик Редактор О. Половка Заказ 2942/34 Тираж 521. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное ие ж те филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4Изобретение относится к биооргвнической химии, а именно к химии углеводов и их производных, и касается способа получения арилламинариолигозидов.Арилгликозиды и -олигозиды находят применение в научных целях какмодельные соединения, Арилолигозидыиспользуют в качестве субстратов дляустановления структуры углеводсодер 1 О. жащих биополимеров - в качестве свидетелей продуктов их взаимодействияс различными классами соединений. Одним из основных стимулов развитияхимии гликозидов является все возрастающий интерес биохимиков к обРширному классу низкомолекулярных Ьиорегуляторов - сердечных, тритерпено-вых, стероидных гликозидов. Многиеарилгликозиды являются биологически 20активными веществами, Так, природное соединение 2-( и -оксифенил)-этил-а-О-глюкопиранозид - действующее начало широко известного лекарственного средства народной медицины "золотого корня",Гликозилирование вещества является трудной, но часто необходимойпроцедурой,. Так, известно, что гликозилирование уменьшает токсичность 30агликонов (например, сердечных гликозидов) и увеличивает проницаемостьвеществ через биологические мембраны,Проблема перевода лекарственных веществ в водорастворимое состояние(что можно осуществить с помощью гликозилирования) хорошо известна фармакологам. Путем изменения углеводнойкомпоненты можно управлять процессами транспорта Ьиологически активных веществ,Большую часть указанных соединений получают путем химического синтеза, однако это почти всегда трудоемкий и многостадийный процесс,45Известен способ получения арилламинариолигозидов, который заключаетсяв следующем.1, Сийтез бензил-0-р-О- глюкопиранозил-Р-О-глюкопиранозида (бензил 50-р-ламинариЬиозида) проводят в несколько стадий:а) конденсацией 2,3,4,6-тетра-О-ацетил.а О-глюкопиранозилбромидас метил-0-Ьензоил,6-0-бензили 55ден-о-О-глюкопиранозидом в присутствии трифтометансульфоната серебра(катализатор) и 1,1,3,3-тетраметилмочевины в дихлорметане получают 2-0-бензоил,6-0-Ьензилиден-0-(2, 3,4,6-тетра-О-ацетил-р-О-глюкопиранозил)-с(.-О-глюкопироназид;б) последовательной обработкой полученного продукта метилатом натрия в метаноле, 60-ной уксусной кис. лотой, смесью уксусный ангидрид-пиридин, 24 Н 50 в уксусном ангидриде получают 1,1,4,6-тетра-О-ацетил- -3-0-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-/Ь-О-глюкопиранозил)-о-О-глюкопиранозид;в) его подвергают бромированию насыщенным раствором НВг в уксусной кислоте при ОоС; получают 2,3,4-три- -ацетил-0-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил- -Р-О-глюкопиранозил)-о-О-глюкопиранозилбромид;г) обработкой которого сухим Ьензиловым спиртом в присутствии цианис,той ртути получают бензил,4,6-три- -О-ацетил-0-(2,3,4,6-тетра-О-аце- тил+О-глюкопиранозил) -Ь-О-глюкопиранозид и далее;д) снятием защитных групп (деацетилирование) метилатом натрия в сухом метаноле получают целевой продукт.2. Фенил-0О-глюкопиранозил- -5-О-глюкопиранозид (фенилламинарибоизид) получают конденсацией 2,3, 4-три-ацетил-,0-(2,3,4,6-тетра- -ацетил-ь-О-глюкопиранозил-аЬО-глюкопиранозил)-с(;О-глюкопиранозилбромида с фенолом в воде в присутствии КОН, Снятие защитных групп проводят так же, как и при получении бензил- -5-ламинарибиозида.Выходы целевых продуктов от йсходных веществ составляют 23-304 1 ,Известный способ обладает следующими недостатками ; для его осуществления необходимо предварительно получить исходные ламинариолигозиды; способ многостадийный (5 стадий) и трудоемкий, требует использования до. рогостоящих, труднодоступных и ядовитых веществ (цианистая ртуть и трифторметансульфонат серебра в качестве катализаторов); требует использования широкого набора органических растворителей и реагентов: этилового спирта, хлороформа, ацетона, фенола, уксусного ангидрида, пиридина, этилацетата, петролейного эфира,фбензилового спирта, уксусной кислоты, причем некоторые из них - после дополнительной очистки и абсолютирования; требует многократной перекристаллизации получаеТ а б л й ц а 1 Пр.оду ктыреакции,4 Время инкубации, ч1Ц Г 48 24 и-Нитрофенилламинарибиозид 19,3 19,8 6,7 12,4 и-Нитрофенилламинаритриозид 8,1 11,3 4,0 и-Нитрофвнилламинаритетраозид 8,6 4,6 5 1013 таточно, так как при сравнении с последующими хроматограммами наблюдаем увеличение количества продуктов синтеза. Инкубация же свыше 24 ч, например 48 ч приводит к исчезнове: з нию высших олигомеров (заметно .сказывается обратный процесс расщепления).Эндо-р,3-глюканаэа (ламинариназа Л 1 У) работает в интервале рН 5,2- 1 В 5,4 в 0,05 М ацетатном буфере. ферментативный синтез протекает при комнатной температуре.Подробное описание синтеза, выделения и идентификации целевых ве ществ дается на примере способа полученйя и-нитрофенилламинариолигозидов (пример 1). Синтез других арил.-. ламинариолигозидов проводят аналогич- но описываемому в примере 1 и поэто му он приведен в последующих примерах без подробного описания процесса.На фиг. 5-10 представлены хроматограммы, отражающие ферментативный 23 синтез арилламинариолигоэидов.П р и м е р 1. ферментативный синтез п-нитрофенилламинарибиозида, -ламинаритриозида и -ламинаритетраозида. ЗФ450 мг ламинарина и 750 мг и-нитрофенилглюкоэида растворяют в 30. мл 0,05 1 йа-ацетатного буфера, рН 5,3. В этот раствор добавляют 0,75 мл эндо,3-глюканазы из моллюска 5 р 1 э а засЬа 11 пепэ 1 з (ламинаринаэа Л 1 У) и инкубируют при 22-25 С 24 ч, если необходимо получить смесь с преобладающим содержанием и-нитрофенилламинарибиозида и и-нитрофенилламинарит 474 6риоэида фиг. 5 или кривая,. на фцг, 4), С целью получения относительно больших количеств и-нитрофенилламинаритетраоэида, смесь инкубируют 4 ч (фиг. 6, или криваяна фиг. 4) .Продукты синтеза анализировали с помощью жидкостного углеводородного хроматографа 1 ео 1 (модель )1.САН). В аналитическом варианте анализ инкубационной смеси на биогеле П(100 х 0,9 см скорость эдюции 7,8 мп/ч, С = 55 С) представляет собой следующую картину (фигц 5): пики 1,2,3,4 и т.д. со свидетелями идентифициРованы соответственно как глюкоза, ламинарибиоза, триоэа, -татраоза и т,д. Пик 1 был идентифицирован со свидетелем как и-нитрофенилглюкозид. По аналогии с разделением продуктов реакции инитрофенилмальтоолигозидов, достигнутым .в работе 1 3 1, где эти гомологи мальтооолигозидов разделяли аналогично жидкостной хроматографией на биогеле Р, пики 5, Ш, 6 принадлежат соответственно и-нитрофе нилламинарибиозиду, -триозиду и тет-, раоэиду. (доказательство - в разделе "Идентификация продуктов" ).Смесь, содержащую набор продуктов ферментативного синтеза, разделяют на препаративной колонке на биогеле П(100 х 3,3 см, с колонки =60 С, скорость элюции 30 мп/ч) на две фракции: ламинариолигосахариды и п-нитрофенилламинариолигозиды. фракцию и-нитрофенилламинариолигоэидов лиофильно высушивают и идентифицируют содержащиеся в ней вещества. Выход индивидуальных компонентов: в пересчете на исходный.,ламинарин приведен в табл. 1.474 8ИдентиФикация продуктов энэиматического синтеза,Идентификацию продуктов проводили несколькими способами:а). Препаративно выделенные про"дукты - смесь и-нитрофенилламинариолигозидов 1 пики 1-1 Х, фиг. 5) " сцелью установления их структуры подвергли ферментативному гидролиэу3-глюкозидазой иэ сладкого миндаля(время инкубации - 9 ч, й=25 С),На Фиг.,11 представлены хроматограммы инкубационной смеси до и последействия /Ь -глюкозидазы (скоростьрасщепления коротких субстратов,наивысшая для этого фермента).Отсутствие на хроматограмме пика 11-п-нитрофенилбиозида, уменьшение пика Я-и-нитрофенилбиозида и появление значительного колйчества выделенной глюкозы, а также увеличение в продуктах ферментативного гид"ролиза свободного и-нитрофенола(увеличение оптической плотностии-нитрофенола наблюдали по увеличению интенсивности скрашивания пробы в щелочной среме при я =400 пт),Все это подтверждает, что синтезированные продукты (пики 11, И 1 и 1 У) содержат и-нитрофенольные радикалы, соединенные р-связью с глюкоэными единицами, т.е. все полученные веществявляются в-глюкозидами;б) . Инкубация смеси продуктов реакции (1- 1 У) с экзоламинариназой ЛП(экэо-ъ,3-глюканаэой, выделеннойиз Ец 1 ойа воаМ 1, специфичность которой установлена: фермент способен гидролизовать р 1,3-связи в р,3-глюканах и р,3-глюкоолигозидах, освобождая последовательно остатки глюкозы с невосстанавливающих концов молекул субстрата; наилучшему расщеплению подвергаются более длинныесубстраты). подтверждает наличиер,3-связанных глюкозных единиц,т.е содержание в составе полученныхвеществ и-нитрофенилламинарибиозида, -ламинаритриозида. и -ламинаритетраозида (фиг. 12);в), фракцию, содержащую и-нитрофенилламинариолигозиды (пики - цг),лиофильно высушивают. ПолученныйтзС-ЯИР-спектр (табл. 2) в сравнениисо спектром ламинарина подтверщдает наличие р,3-связи между остатками глюкозы и отсутствие других типов гликозидных связей.в данных веществах. 7- 1013Препаративное разделение инкубационной смеси с получением индивидуальных целевых компонентов возможно на биогеле П(аналогичнофиг. 5 и 6), причем выделенные не-прореагировавшие до конца. и-нитро, фенилглюкоэид и ламинарин можновновь запускать в последующий синтез. Как видно из табл. 1, с течением времени количество арилламина фриолигозидов, особенно высших,начинает убывать, поскольку онитакже являются субстратами дляламинаринаэы Л 1 У, и по мере уменьшения концентрации истинного суб- нстрата - ламинарина фермент начинает гидролиэовать им же синтезйрованные, более короткие субстраты. Таким образом, варьируя концентрации исходных веществ, активность фермента либо время инкубации,получают наиболее оптимальные условия производства арилламинариолигозйдов с достаточно высоким выходом,П р и м е. р 2. Синтез 1-нафтиллами-нариолигозидов осуществляют аналогично примеру 1, только в качестве:акцептора используют 1-нафтил-Ь-О-глюкопиранозид (фиг. 7) . Продолжительность - 4 ч.-триозид 7,98; -.тетраозид 4,56.П ри м е р 4. Синтез фенилламинарнолигоэидов проводят по примеру1, в качестве акцептора используют 4-:фенил-р-О-глюкопиранозид (фиг.9).Продолжительность - 4 ч,Выход продуктов составляет, 4;фенилламинарибиозид 2,1,62; -триозид. 6,67.МП р и м е р 5. Синтез 4-метилумбеллиферилламинариолигозидов; акцептор - 4-метилумбеллиферил-р-О"глюкопираноэид. Время инкубации 24 ч, ИВыход продуктов составляет, 1:4-метилумбеллиферилламинарибиозид11, 12; триозид 2,42; -тетраозид 2,2410 Таблица 2 013474 Химические сдвигиь юев меССССС С3 Исследуемые вещества 103, 28 74,13 .85,32 69,30 76,60 61 у 90 Ламинарии в ДО Сумма п-нитрофенилолигозидовпики -1 У) в ДО 104,13 74,13 85,32 69,33 76,20 61,20 Использование предлагаемого способа получения арилламинариолигозидов обеспечивает пр сравнению с из; вестным способом следующие преимущества: возможность одновременного получения нескольких арилламинариолигозидов непосредственно из ламинари" на (без предварительного получения исходных ламинариолигозидов; ферментативный синтез идет в:одну стадию, в то время как известный способ отличается многостадийностью (5 стадий) и трудоемкостью отдельных процессов;, удается избежать многочисленных операций по упариванию,фильтрации, перекристаллизации ит.д, на промежуточных стадиях, имеющих место в известном способе; способ не требует использования дорогостоящих катализаторов и ядовитых веществ; не требует специально подготовленных органических растворителей;способ не требует специальных услор вий.