Способ получения ноурзеотрицина

(5 ц 4 С 12 Р АНИЕ ИЗОБРЕТЕН стьитауе ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ П(НТ СССР ОПИСК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(54) С 1 ЮСОБ 1 ЮЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Цель изобретения - повышение концентрации целевого продук та в культуральной жидкости, Сущнопредложения сводится к тому, что птельную среду для выращивания продцента Ягерйошусев поцгзе 1 А 3890подвергают стерилизации, при этомв среду дополнительно вводят Фосфатосаждающие ионы металлов и карбонаткальция, концентрацию ионов сульфатаувеличивают и подщелачивают среду дляснижения концентрации фосфатов.В процессе Ферментации, осуществляемой в условиях аэрации и перемешивания, регулируют величину рН, концентрацию ггпокозы и аммонийного азота, а начиная с 1,5-2 ч от началаферментации дробно подают в культуральную жидкость Фосфаты. После завершения Ферментации выделяют целевой продукт. 5 табл.50 Таким образом, общий фосфат различного содержания, переносимый через комплексные субстраты в среду глу- .бинного культивирования, присутству 55 ет в начале ферментации в виде растворенного немедленно доступного фосфата. Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть ис поль э ов ан о для получения стрептотрицинового антибиотика ноурэеотрицика.В случае биосинтеэа микроорганизмом Бггергошусез 1 МЕТ 1 А 3890 Ь стрептотрицинового антибиотика ноурзеотрицина известно, что аминокислоты и аммонийные соли отрицательно влияют на этот биосинтез (СгаГе, Б., Яйепда 1, А., Вос 1 ег, Н.и ТЬгцш, Н. ,А 11 я. МЖгоЬо 1. 20; 185-194, 1980.Недостатком технического примене" ния является то, что нитрат аммония является взрывчатым веществом и использование его допускается только в сочетании с мерами безопасности. Кроме того, обнаружено в фильтрате культуры в конце лабораторной ферментации не более 3000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл только при прибавлении относительно дорогих и вредных для окружающей среды ингибиторов ды хания и переноса аминокислот, например о-аминобензойной кислоты (ОАВА) (СгаГе, П., ВосМег, Н., Кепйагдг, С. и ТЬгцш, Н. Е. А 11 я, МдКгоЬю 1 14, 659-673, 1974. 30Известно, что избыточный фосфат отрицательно влияет на биосинтез ря" да вторичных метаболитов (Маггдп, З.Р Адл . В 1 осЬеш. Епя. 6, 105-127, 1977. Поэтому некоторые технические процессы микробиологической фермента 35 ции для получения антибиотиков проводят при концентрациях фосфата, субоптимальных для роста микробиологического продуцента. В технических ферментациях для получения вторичных метаболитов, как правило, используют такие компоненты среды растительного и животного происхождения, как крахмал, соевый шрот, кукурузный экст" ракт, меласса, мясной экстракт и др. Общее содержание фосфата и биологическая доступность (растворимость) комплексного субстрата различное в зависимости от его происхождения и обработки. Цель изобретения - повышение концентрации целевого продукта в культу- ральной жидкости.При ферментациях для получения ноурзеотрицина после понижения началь- ной концентрации фосфата ниже считав-, шегося ранее оптимальным значения и последующего прибавления соответствующего или более высокого количества фосфата в процессе культивирования, добавляемого по определенному режиму времени, получаются значительно более высокие выходы ноурэеотрицина.Кроме того найдено, что в СаСО- содержащей питательной среде при замене источника азота нитрата аммония на сульфатсодержащий сульфат аммония в соотношении, стехиометрическом в отношении содержания азота, начальная концентрация фосфата снижается от 15 мг/л фосфатного фосфора (Р) до 1-3 мг/л в собственно неизменной среде после стерилизации водяным паром под давлением.Начальную концентрацию растворимого биологически немедленно доступного фосфата в простерилизованной среде можно снизить соответствующим согласованием режима стерилизации и содержания сульфатньгх ионов и неорганических солей или ионов металлов, дающих вместе с фосфатными или сульфатными ионами трудно растворимые осадки. фПричиной снижения такой начальной концентрации в случае присутствия достаточного количества сульфатных ионов является сдвиг кислотности слабокислой питательной среды в сторону щелочных значений рН в процессе стерилизации, вызываемый осаждением СаВО и связанный удалением из среды физиологически кислых сульфатных ионов, Соответственно начальная кон центрация растворимого или биологически доступного фосфата снижается также вследствие установки щелочного значения рН перед стерилизацией, Увеличение значения рН обеспечивает создание благоприятных условий для осаждения фосфата с определеннымипрйсутствующими в питательной среде ионами металлов, Осаждению фосфатсодержащих осадков способствует направленное прибавление таких ионов металлов, как, например, железо (111), 1451165алюминий (111), магний (11), кальций (11), цинк (11) и другие.Особенно благоприятное влияние на осаждение фосфата оказывает применяемый в большинстве технических ферментаций метод стерилизации непосредственно воздействующим водяным паром под давлением, а также присутствие СаСО, который используется в качестве буфера для регулирования рН в процессе ферментации.Содержание фосфата.можно снизить также уменьшением доли фосфатсодер жащих комплексных субстратов. Так, например, используемый в ферментации ноурзеотрицина экстракт соевого шрота содержит около 8 г фосфатного фосфора на 1 г шрота.В перечисленных условиях начальная, концентрация растворенного или доступного фосфата настолько низкая, что специфические для ноурзеотрицинопродуцирующих микроорганизмов верхние предельно допустимые значения фосфата остаются ниже этого предела. Таким образом, такие небольшие концентрации фосфата позволяют путем прибавления определенного количества, фосфата после стерилизации получить30 среду, в значительной степени стандартизованную по фосфату. Кроме того, режим подачи фосфата позволяет управлять фосфатным обменом микроорганизмов таким образом, чтобы можно было получить продукт с высоким выходом. 35 Фосфат может подаваться в виде раствора или твердого вещества или суспензии. Фосфат может присутствовать либо в форме свободных фосфатных ионов, либо в виде химически или фи зически связанного фосфата. Подачу фосфата или фосфатсодержащих веществ осуществляют в зависимости от режима подачи после стерилизации или во время ферментации способом разового 45 и/или многоразового и/или непрерывного прибавления, Непрерывное прибавление фосфата может осуществляться с различной скоростью подачи во время. ферментации. 50Изобретение поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Лиофилизированные на почве консервированные споры селектанта ИС 13-14 ноурзеотрицинообра" 55 зующего штамма Ясгерошусеэ поцгзе 1 МЕТ 1 А 3890 Ъ высевают на подходящую агаровую среду, например, агар Эмерсона. Примерно через 7-дневныйопериод инкубирования при 30 С вырезают участки мицелиального газонаразмером около 2 см, а ими засеваюткультуру предварительного выращивания. Среда предварительного выращивания содержит на 1 л водопроводнойводы следующие вещества, г: глюкоза40, обезмасляная соевая мука 15,КНРО 0,3, МаС 1 5 и СаСОз 3. Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией на значение рН 6,5. Этусреду заливают в закрываемые ват,ной пробкой широкогорлые бутылкиемкостью 500 мл каждая в количествахпо 50 мл. Стерилизацию осуществляюто,35-минутным нагревом до 121 С в автоклаве.Засеянные культуры предварительного выращивания инкубируют в течение 48 ч при 29 С на качалке. Припомощи 150 мл полученного таким образом посевного материала засевают2500 мл основной культуры в лабораторном ферментаторе.Для основной культуры используютсреду, содержащую в 1 л следующиепитательные вещества, г; картофель-ный крахмал 32, глюкоза 29, обеэмасленая соевая мука 11, (МН 4)БОо 11,МяЯОх 7 НО 2, ИаС 1 1, СаСО 6 иЕпБО 7 Н О 0,5. На 2500 мл питательной среды прибавляют 1 мл антафронав качестве пеногасителя на силиконовой основе. Кислотность перед стерилизацией имеет значение рН 6,0.После стерилизации заполненного250 мл культуральной жидкости ферментатора при 121 С в автоклаве иофпоследующего охлаждения до 30 С стартовую кислотность устанавливают отрН 8,4 до рН 6,8, прибавляя асептическую добавку 10/-ной стерильнойсерной кислоты. Засеянные ферментационные среды инкубируют в течение168 ч при 30 С и скорости аэрации2500 мл воздуха в 1 мин при перемешивании с числом оборотов 800 об/мин..Спустя 1,5 ч после засева основнойкультуры, при помощи перистальтического насоса-дозатора непрерывно прибавляют раствор 4 г КНРО 4 на 1 лдистиллированной воды в течение 5 чсо скоростью подачи 1,8 мл/ч; вследза этим раствор прибавляют в течение21 ч со скоростью дозирования3,5 мл/ч. Во время ферментации васептических условиях периодически54511 берут пробы культуральной жидкости и в них методом диффузии в агар с использованием микроорганизма Вас 11- 1 из эцЬг.111 э АТСС 6633 в качестве5 тест-микроорганизма определяют содержание ноурзеотрицин-основания, глюкозы, аммонийного азота и твердых веществ. Параметры РО, рН и содержание СО в отходящих из аппарата газах контролируют в ходе/процесса методом измерения с регистрацией., Снижение значения кислотности культуральной жидкости ниже значения рН 5,8 предотвращают прибавлением стерильного 57.-ного раствора едкого натра.При снижении концентрации глюкозы до 5 г/л или. аммонийного азота до 0,5 г/л, что отражается на увеличении измеренных значений рН и РО , а также на снижении содержания СО в отходящих газах, прибавляют периодически 25 г глюкозы или 1 О г (БН 4) БО 4 в виде концентрированных 25 стерильных растворов.Дальнейшую ферментацию проводят без прибавления КНРО 4, глюкозы и (ИН 4) 504 в аналогичных условиях. После прекращения Ферментации в культу- ЗО ральной жидкости присутствуют четко обнаруживаемые .количества глюкозы и аммония. Концентрации ноурзеотрицин-основания, определенные в фильтратах культур обоих различных ферментационных процессов, приведены в табл. 1.П р и м е р 2. Лиофилизированный на глюкоэо-желатине консервированный мицелий (вес брутто консервированного содержимого - около 300 мг) названно-, го в примере 1 ноурэеотрицинообразующего штамма стрептомицетов суспендируют с 3 мл 0,9 Х-ного раствора хлористого натрия, 0,5 мл этой суспензии45 служит в качестве инокулюма для 400 мл. среды предварительного культивирования первой стадии.Среда предварительной культуры имеет тот же состав и кислотность, что в примере 1, Среду заливают в эаэО крываемые ватной пробкой широкогорлые бутылки емкостью 2500 мл в количествах по 400 мл. Стерилизацию проводят 35-минутным нагревом до 121 С в авто 55 клаве.Охлажденные до комнатной темпера- туры и засеянные культуры инкубируютов течение 48 ч при 29 С на качалке 65 6(180 об/мин). Нспользуя 1200 мл полученной таким образом культуральнойжидкости первой предварительной культуры, на второй стадии предварительного культивирования засевают 150 лтермостерилиэованкой среды (в тече-.ние 60 мин при 121 С) такого же сос;тава, как на первой стадии предварительного культивирования, содержащейся в ферментаторе из специальной высококачественной стали (общий объем250 .л), оснащенном устройствами дляподачи стерильного воздуха .и перемешивающим устройством. Культивированиепроводят при 27-29 С, скорости работыперемешивающего устройства 240 об/мини скорости подачи воздуха 1 л на 1 лкультуральной жидкости в 1 мин.Для основной культуры используютферментаторы из специальной высококачественной стали (общий объем -710 л), оснащенные устройствами дляподачи стерильного воздуха и расположенным в центре аппарата перемешивающим устройством, которые заполнены500 л питательной среды каждый (рецептуру см. пример 1)В качествепеногасителя прибавляют, 0,5 г/л антафрона. Кислотность устанавливаютперед стерилизацией на значение впределах рН 6,7-7,0. Стерилизациюпитательной среды (без компонентаглюкозы) проводят на месте предварительным подогревом паром рубашки примерно до 70 С и последующим нагревомострым паром до 121 С в течение15 мин, После охлаждения до темпераотуры около 30 С прибавляют в асептических условиях глюкозу в виде 507 ного водного раствора, раздельно простерилизованного 30-минутным нагревомдо 121 С, Перед посевом при помощистерильной 10 Х-ной серной кислотыснижают стартовую кислотность рН8,6 до значения в пределах рН 6,9-7,1.Ферментационные среды основнойкультуры, засеянные каждая 5 Х иноку-,люма второй стадии предварительногокультивирования, культивируют в течение 120 ч при температуре в пределах 28-30 С и со скоростью подачивоздуха 500 л в 1 мин (давление0,14-0,16 МПа) при перемешивании(320 об/мин),К одной из двух культур Ферментатора, начиная со 2-го.ч и кончая 32-мч после засева, прибавляют при помощи перистальтического насоса-доэато14511 40 ра с постоянной скоростью водныйраствор, содержащий 87 мг/л КНРО,так что в течение 30 ч на 1 л культу Вры прибавляют 40 мг Фосфатного Р.Во время Ферментации в асептичес 5ких условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в нихметодом диффузии в агар с использованием микроорганизма Вас 111 э зоЬй 11 хз 1 ОАТОС 6633 в качестве тест-микроорганизма определяют концентрацию ноурэеотрицин-основания и содержаниеглюкозы, аммонийного азота и твердыхвеществ. Параметры рН и содержаниеСО в отходящих газах контролируютв ходе процесса измерением с регистрацией.При падении концентрации глюкозыниже 5 г/л или аммонийного азота ниже 0,5 г/л, что видно по нарастаниюзначений рН и снижению содержания СОв отходящих газах, периодически прибавляют 5000 г глюкозы или 1800 гсульфата аммония в виде концентрированного стерильного водного раствора.В другую культуру ферментаторафосфата глюкозу или сульфата аммонияне добавляют. Регулирование значениярН не осуществляется; непрерывно измеряемые значения кислотности лежатв пределах рН 6,4-7,2. В момент прекращения ферментации в культуральнойжидкости содержится более 5 г/л глюкозы и 0,5 г/л аммонийного азота.35Концентрация ноурэеотрицин-основания, определенные в Фильтратах культур обеих различных ферментаций, приведены в табл. 2,П р и м е р 3. Лиофилиэированный на глюкозо-желатине консервированный мицелий (вес брутто консервированного содержимого около 300 мг) селектанта ноурзеотрицинообразующего штамма ИЕ. 1 А 3890 Ь обрабатывают в отношении предварительного культивирования, как описано в примере 2.Для основной культуры используют лабораторный Ферментатор общим объемом 7 л, оснащенный устройствами для подачи стерильного воздуха и располо-. женным в центре перемешивающим устройством, который заполняют 4,5 л питательной среды.Культивирование проводят в модифи цированной среде (по примеру 1), содержащей 60 г/л глюкозы. В качестве пеногасителя прибавляют 0,5 г анта 65 8фрона ММна 1 л культуральной жидкости.Для моделирования технических условий стерилизацию проводят в Фермента- торе из специальной высококачественной стали, заполненном 2500 л питательной среды без глюкозного компонента. Кислотность устанавливают перед стерилизацией на рН 7,4. Стерилизацию проводят на месте предварительнымо подогревом паром рубашки до 75 С и последующим нагревом острым паром до 120 С в течение 5 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в виде 50 Х-ного расто вора 30-минутным нагревом до 120 С. Перед засевом понижают стартовую кислотность от значения рН 8,1 серной кислотой таким образом, чтобы стартовое значение рН составляло после засева 7,4. Ферментационную культуру засевают 4 Е инокулюма второй стадии предварительного культивирования. Для проведения опыта из ферментатора переводят 4,5 л среды в лабораторный ферментатор, который стерилизуют раздельно в незаполненном состоянии в автоклаве.Основную культуру выращивают в течение 146 ч при 29 С и скорости аэрации 4,5 л воздуха вмин, Начальное число оборотов перемешиваю- щего устройства 800 об/мин увеличивают для улучшения снабжения культуры кислородом; начиная с 28-го ч число оборотов мешалки составляет 1000 об/ /мин. Между 2 - м и 40-м ч после засева при помощи перистальтического насоса прибавляют 784 мг КНРО 4 в виде водного раствора с разной скоростью подачи в пределах 1,25- 1,75 мг фосфатного Р в 1 ч и на 1 л культураль ной жидкости. Автоматической подачей 25 Х-ного водного раствора аммиака обеспечивают поддержание регулируемого значения на уровне не менее рН 6,2 и тем самым достаточное снабжение культуры аммонийным азотом, Глюкозу прибавляют периодически в виде концентрированного водного раствора тогда, когда результаты анализов, проводимых по ходу ферментации, показывают падение концентрации глюкозы ниже 10 г(л. Во время ферментации в асептических условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в фильтратах культуры определяют кон,Содержание ноурзеотрицина в культурах штамма Бйгерйотусеэ поцгэед1 МЕТ 1 А 3890 ЬНС 13-14 с добавками КНРО, глюкозы и (ИН)80и без добавок в лабораторном ферментаторе в зависимости от времениФерментации Время ферментации, ч Без добавок (контроль) С добавкамих мкг/мл Х кг/мл 249 415 24 1035 100 165 294 48 72 29805412 1805 1840 100100 96120 213195 3905 4520 8311 8800 100 100 213 4005 9230 140,100 9 14 центрацию ноурэеотрицин-основания методом диффузии в агар (табл, 3).П р и м е р 4, В процессе Ферментации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка среды основной культуры заменяют на 0,2 г/л . Ре (ЯО) 9 Н О. Концентрация ноурзеотрицина в фильтрате культуры составляет после 120-часовой ферментации 8200 мкг/мл (табл. 4).П р и м е р 5, В процессе ферментации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка заменяют на 0,13 г/л А 1(БО) 18 И О. Концентрация ноурзеотрицина в Фильтрате культуры составляет после 120-часо,вой ферментации 8400 мкг/мл (табл.4) .П р и м е р 6. В дальнейшей Ферментации, проводимой аналогично примеру 5, количество содержащегося в питательной среде обезмасляного соевого шрота снижают от 11 до 4 г/л. Далее значение рН среды устанавливают перед стерилизацией разбавленным водным раствором едкого натра на рН 8,1. После стерилизации паром под давлением значение рН устанавливают концентрированной серной кислотой таким образом, чтобы.оно составляло рН 7,2 после засева, фосфат прибавляют между 2-м и 72-м часами при помощи водного раствора КНРО, который прибавляют с постоянной скоростью таким образом, чтобы было обеспечено снабжение Фосфатом в количестве 1,4 мг Фосфатного Р в 1 ч и на 1 л культуральной жидкости. В процессе ферментации глюкозу пе 51165 10риодически прибавляют такими образомчтобы концентрация глюкозы не снизилась ниже 1 г/л. Значение рН поддерживают титрованием 257.-ным раствором гидроокиси аммония на уровнерН 6,О.Получаемые концентрации ноурэеотрицина приведены в табл, 5.Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет повысить концентрацию антибиотика в культуральной жидкости. Формула изобретения Способ получения ноурзеотрицинапутем Ферментации штамма Бггер 1 ошусезпоцгэе 1 А 3890 в стерильной питательной среде при аэрации, перемешивании и регулировании величины рН,концентрации глюкозы и аммонийногоазота с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й 25 с я тем, что, с целью повышенияконцентрации целевого продукта вкультуральной жидкости, начало ферментации ведут при лимитированиифосфата, при этом снижение начальнойЗ 0 концентрации фосфата в питательнойсреде осуществляют в процессе стерилизации в присутствии фосфатосаждающих ионов металлов и карбонатакальция с одновременным повышениемвеличины рН среды и концентрации иоЗБнов сульфата, а через 1,5-2 ч от начала ферментации осуществляют дробнуюподачу фосфата в культуральную жидкость,1451165 Без добавок (контроль) Время ферментации, ч С добавкамиф кг/мл Х мкг/мл Х 104 225 216 100 20 1600 228 44 702 100 16274858 68 299 100 4903 208 2362 92 100 116 6862 191 3585 100 144 7781 200 2885 100 Т а б л и ц а 3 Содержание ноурзеотрицина в культуре селектанта штамма БГгерГошусея поогяед 1 ИЕТ 1 А 3890 Ьс добавками КНРО, глюкозы и (ХН) ЫО в ферментаторе емкостью 4,5 л в зависимости от времени ферментации 1 Время ферментации, ч Концентрация ноурзеотри 1 ина, мкг/мл 20 320 44 2330 68 6240 8010 92 116 1 040 14070 146 Т аблица 2Содержание ноурэеотрицина в культурах штамма Бггерйошусея поцгяех 1 МЕТ1 А 3890 ЬНС 13-14 с добавками КНРО, глюкозы и (ИН) БО и бездобавок в ферментаторе емкостью 500 л в зависимости от времениферментации10 Концентрация ноурзеотрицина, мкг/ /мл, по примеру Время фермента- Концентрация но"ции, ч урзеотрицина,мкг/мл Время ферментации Ч 15 24 800 24 48 48 2000 5660 20 96 8900 96 11000 120 Составитель Редактор М.Недолуженко Техред А,Кравчук Корректор И.ЭрдейиЗаказ 7036/20 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 11,3035, Москва,.Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 13 145116Таблица 4Содержание ноурзеотрицина проведенной ферментации в соответствии с примером 4 с ионами железа (111) и5 ферментации в соответствии с примером 5 с ионами алюминия (111) в зависимости от времени ферментации 530 800 2500 3200 5400 6300 7250 7400 8200 8400 14Таблица 5 Содержание ноурзеотрицина в культуральной жидкости лабораторного ферментатора с добавками КНР 04, глюкозы и гидроокиси аммония, содержащей ионы алюминия ( 111), в зависимости от времени фер- ментации