Способ обработки содержащей полисахарид культуральной жидкости хаnтномоnаs самреsтris

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК ЯО 14299 б 94 СГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАН ИЗОБРЕТЕНИ ПАТЕНТ раствора,гетерополисахарида,которыиГ может быть использован в процессах вторичного и третичного извлечения нефти. Целью изобретения является повышение качества обработки за счет улучшения физико-химических свойств раствора. Способ заключается в том, что культуральную жидкость Хапййошопаз сашрезг 1.з подвергают энзимотической обработке препаратом Новозим 234, который содержит сбалансированное соотношение различных видов гидролитических ферментов. При этом перед введением ферментного препарата культуральную жидкость предварительно:, прогревают, Полученный раствор обладает лучшими фильтруемостью, прозрачностью и впрыскиваемостью. 5 табл7итэ Шимик (РЕ)эн Жарри 2 Р 19 06 ОДЕРЖАЩЕЙой жидкости тся к ботки отех ног(72) Жан-Пьер Гозар, Али Алэн Люссиони (РК)(54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ ПОЛИСАХАРИД КУЛЬТУРАЛЬ ХАБТНОМОИАБ САМРЕЯТК 18 (57) Изобретение относ нологии и касается обр 1/02, С 12 Р 1/06//19/06, С 12 К 1:64)Изобретение относится к биотехнологии и касается обработки водного ;раствора гетерополисахарида, которыйможет быть использован н процессах5вторичного и третичного извлечениянефти.Цель изобретения - повышение качества обработки за счет улучшения физико-химических свойств раствора,Растворы полисахаридов, представляющие собой гидрофильные коллоиды, ;:получают в результате ферментации , бактерий вида ХапгЬовопая савреяггьяна углеводном сырье. Пригодные для использования с этой целью углеводы -глюкоза, сахароза, фруктоза,мальтоэа, .лактоза,крахмал. Сбраживание углевода ,осуществляется, как правило, в водной .:.среде, содержащей до 100 г/л углево.: да. Среда брожения может, кроме того, , содержать источник фосфора, источник .;магния, который является активатором , энзимов, и источник азота, который .может быть органического, минерально" 25 ; го или смешанного, органоминерального,происхождения.В результате процесса брожения и производства полисахарида культуральная жидкость (сусло) обычно содержит30 примерно 15-50 г/л полимера, а также различные составляющие, включая клетки бактерий, клеточные остатки, остаточные протеины, и минеральные ионы.Биополимер может быть извлечен из сусла посредством осаждения с помощью агента осаждения, например изопропанола, фильтрации и сушки.Способ согласно изобретению можно применять к растворам, полученным посредством разведения коммерческого биополимера в порошке, однако наиболее целесообразной с целью дальнейшего применения для извлечения нефти . использовать культуральную жидкость. 45 Содержащий мутаназу энзим добавляют к водному раствору, содержащему0,15 - 30 мас,7. полисахарида, и смесьвыдерживают при перемешинании или безнего при температуре от температурыоокружающей среды до бО С, предпочтиотельно 25 - 55 С, в течение 4 - 24 чи более при рН 3,5-7. Целесообразноустановить рН равным 4-5,8 посредством добавления минеральной или орга 55нической кислоты, например серной,фосфорной, азотной, уксусной, муравьиной,Если подлежащий обработке раствор приготовлен.из выделенного из бро- . дильного сусла порошок, целесообразно, чтобы концентрация полисахарида была 0,25-1,5 Е.Если обрабатывают цельное бродильное сусло, концентрация полисахарида, как правило, составляет 1,5-20 мас.7., Цельное сусло может быть продуктом, непосредственно полученным в результате брожения, в этом случае концентрация составляет 1,5-57,. Или это может быть сусло, сконцентрированноетрадиционными методами до содержания полисахарида.примерно 207Способ обработки растворов полисахаридов включает энзиматическую обработку и заключается во введении н контакт этих растворон с эффективным количеством сложного энзима, содержащего мутанозу.Мутанозы представляют семейство энзимов, главное общее свойство которых заключается в их способности воздействовать на 1,3-глюкозидные связи н положении альфа. Мутаназы получают посредством культивации соответствующих микроорганизмов на среде, основным источником. углерода которой является мутан, выделяемый каким-либо стрептоккоком, например Яггергососсця вцгапя СВ Б У 350-71. Микроорганизмы, генерирующие мутаназы, это Тг- сйойегва Ьагуавив, Реп сь 111 цв Гцпьсц 1 ояцв, Репс 113 цв ве 1 м 2, Реп- сз 11 ьцв 1 апг 1 ппе 11 цв. Содержащий мутаназу продукт, который предпочтительно используется впредлагаемом способе, получают изТгсЬос 1 егва Ьагц 1 адцв, КультивациюТгьсйойегва Ьаг 81 аоцв осуществляют сцелью получения о -1,3-глюконазы 1 мутаназы), способной гидролизовать Ы -1,3-глюкан,В ходе энзиматических микробныхфброжений в отсутствие особых.опти-.,мальных условий получают несколькородственных энзиматических составляющих при сравнительно постоянных соотношениях. Промьппленный продукт, который используется согласно изобретению, продается под торговой маркойНовозим 234 фирмой %то 1 пс 1 цяг 1А/Б. Этот энзим проявляет, помимогланной матаназной активности, целлулазную, ламинариназнук, ксиланазную,хатиназную и прс тецназную активность.Количество сложного энзима, добавляемого к водному раствору, должнобыть достаточным для обеспечения разложения нерастворимых полисахаридов.и бактериальных клеточных остатков.Это количество одновременно зависит от энзиматической активности комплекса, от содержания в подлежащемобработке растворе нерастворимых веществ и от условий энзиматической обработки.При использовании комплекса Новозим 234 обычно достаточно количества0,1 - 3 мас.7. по отношению к массексантеновой смолы., Рациональное количество может также быть расчитано поотношению к азоту, содержащемуся всреде и исходящему главным обраэом-иэ биомассы. Энзимав количестве 20- 20150 г, предпочтительно 40-100 г, на100 г азота, как правило, достаточнодля разрушения и бактериальных остатков, и нерастворимых веществ небактериального происхождения. 25Энзиматическую обработку можнотакже проводить с растворами полисахаридов, которые предварительно ос- .ветлены известными методами, напримерпосредством пастеризации, центрифугирования, фильтрации через диатомныеземли и т.д,Раствор полисахарида, которыйпредставляет собой цельное бродильное сусло, до энзиматической обработки подвергается нагреванию до 60 -150 С в течение от 5 мин до 2 ч. Установлено, что сочетание термическойобработки с знэиматической обработкой приводит к заметному осветлению 40растворов ксантановой смолы. Лучшиерезультаты с точки зрения свойствагента вязкости, фильтруемости ивпрыскиваемости получены с помощьютермической обработки бродильного сусла при рН 3,5 - 6,2, предпочтительно4 - 5,5, при температуре 60-110 С,опредпочтительно 80-100 С, в течение5-60 мин, предпочтительно 15-30 мин,за которой следует обработка комплек 50сным энзимом.Получаемые в результате знзиматической обработки растворы гетерополи".сахаридов, а также выделенные из этихрастворов порошки могут быть использованы во всех случаях, когда требу 55ются осветленные продукты, напримерпри вторичном и третичном извлечениинеФти.Слабоконцентрированный раствор экономически невыгодно транспортировать. При испльзовании полимера в порошке возникает проблема повторного растворения на месте пользования. В определенных случаях целесообразно производить концентрирование раствора биополимера, Концентрация может быть осуществлена с . помощью традиционных приемов, например выпаривания или ультрафильтрации. Последний метод является предпочтительным, так как он более экономичен и позволяет разде. - лять в промьппленных условиях молекулы с низким и высоким молекулярным весом и концентрировать полимеры без изменения их реологических свойств. Установлечо, что ультрафильтрация даже при высоком градиенте скорости не изменяет свойств агента вязкости и фильтруемости растворов.Концентрация путем ультрафильтрации может осуществляться с использованием известных технологий и оборудования, например с помощью аппаратов с филь. тровальными патронами, спиралями, тру-бами. Предпочтительно использовать аппараты с рифленными фильтровальными патронами, в которых полимер может быть подвержен высоким градиентам скорости (1000 - 10000 с),значи-. тельно снижающим реальную вязкость продукта, что позволяет осуществить быструю транспортировку в промьпплен,ных аппаратах с большой поверхностью (10-50 м ) и улучшенный перенос. Для данного процесса можно использовать мембранные фильтры, например, из целлюлозы, полиамида, полибензимидазола, акрилового сополимера, полиакрилоннтрила, полисульфона, полифторида винилидена, сложных комплексных поли- электролитов, пороги фильтрации которых 10 - 100000.Расход зависит от температуры, давления, скорости прохождения, а также от вязкости и концентрации биополимера и составляет 5-50 лч мпри линей. ной скорости 0,5-5 м/с, Темггература может быть от температуры окружающейосреды до 80 С, давление - порядка 1 - 15 бар, предпочтительно 1-6 бар.Обычно ультрафильтрация позволяет получить концентрацию 70-180 г биополимера на 1 кг сусла. Если сложный энзим добавляют до ультрафильтрацни, энзиматическая реакция продолжается во время фазы концентрации полимера.Возможна очистка раствора полисахарида с помощью диафилвтрации пос-,редством постоянноГо или периодического добавления воды во время или5после ультрафильтрации со скоростью,в значительной мере соответствующейскорости отбора ультрафильтрата. Молекулы с низкой молекулярной массой,получаемые в результате реакции эн О:зиматического разложения, удаляютсяв пермеат. Очищенный таким образомпродукт обладает улучшенными свойствами по вязкости,Термическая обработка в кислой.среде в сочетании с энзиматическойобработкой позволяет улучшить показатели ультрафильтрации по сравнениюс необработанным термически суслом,или с суслом, которое подвергнуто обработке в условиях нейтрального или щелочного рН. В частности, при той же потере напряжения на контактах ультра- .;фильтрата термическая обработка вкислой среде позволяет получить более 25,концентрированные растворы биополиме;ра при более значительных расходахпитания, Таким образом, можно полу-.чить концентрацию 200 и даже 300 г па1 кг сусла. 3011 р и м е р 1, Используют бродильное сусло с содержанием ксантено- .вой смолы 18 г/л, полученное в результате брожения Хатт 1 топтопав сашревт з.в.35Одну Фракцию сусла концентрируютпосредством ультрафильтрации, используя прибор ПРР 10, снабженныймембранными патронами 1 218 3038 т,торговыемарки инофирмы "Рон Пуленк Решерш"), 40до концентрации 112 г биополимера накг сусла.Устанавливают рН второй фракции5,5, добавляя концентрированную серную кислоту, затем эту фракцию нагре- т 5вают до 100 С в течение 15 мин, Послеохлаждения сусло концентрируют ультрафильтрацией, как и первую Фракцтпо, доконцентрации 112 г/кгК 1 кг каждой Фракции концентриро- ,ванного сусла добавляют 1,1 г Новозима 234 (торговая марка фирмы Боло1 п цв 1:гт А/8). Смесь выдерживают 14 чопри 30 С при перемешивании, затем охлаждают до температуры окружающей сре.55дыГля обработанного таким образомсусла определяют вязкость раствора сконцентрацией ксантановой смолы1000 м.д., содержащего 5 г/л БаС 1,а также мутность раствора при1000 м дИзмерения вязкости осуществляетсяс помощью вискозиметра Брукфилда,оснабженного приставкой 1 П при 25 Сдля степени сдвига 7,3 сМутность определяют посредствомизмерения оптической плотности при650 нм для оптического пути 4 см.Результаты представлены в табл.1. Таблица 1 Вя экос ть, ОптическаямПа" с плотность Сусло Обработано Новозимом 234 без термической обработки 42,5 0,45 Обработано при 100 С, рН 5,5, затем обработано Новозимом 234 0,144 Обработано при100 С, рН 5,5не обработано(контроль) 59,5 0,749 П р и м е р 2. Используют бродильное сусло, содержащее 80 г ксантановой смолы на 1 кг сусла, котороесконцентрировано непрерывным способомс помощью ультрафильтрации из неочищенного сусла с концентрацией15,6 к/кг, обработанного при рН 5,5в течение 15 мин при 00 С, и безтермическои обработки.К 1 кг концентрированного сусладобавляют 1 г Новозттма 23 Г. Смесь высъдерживают 14 ч при 40 С при перемешивании, затем охлажда.от до температурыокружающей среды.Эффективность обработки относительно способности к Фильтруемости иА, Авпрыскиваемости определяется по тестамкоторые описаны ниже, в сравнении стаким же суслом, не полттерженным энзиматической обработке,Результаты препстатлены в таб.гт.2,,1429938 Таблньпа 2 Оптическая ПЛОТНОСТЬ астворов 1000 м.д.Об рыскинаемость прн 3 бар- время диаметре пор, мкм Фильтруемость прн постояном расяоде - Ьр мбар,прн диаметре пор, мам о 15 мнн рн 5,860 асорени ет Не рас 11. -ром45сло раз. Для срав из Фракции матическойРазводят жащей соли,имер выделяют а, но до энзи нения биопо того же сус обработки. водой, содер есителя марк 5 г порошк с помощью Испытание истечения или Фильтруемости с постоянным расходом позволяетустановить явление засорения, котороеможет проявиться при впрыскиванииразведенного раствора биополимерав залежи нефти и, следовательно, измерить пригодность раствора биополимера для применения в ходе сопутствующего извлечения нефти.Принцип этого испытания заключает- а 0ся в том, что растворы с постояннымрасходом пропускают через калиброванный фильтр, Потеря давления ( лР)на контактах фильтра, вызванная прохождением раствора биополимера, ха 35рактеризует пригодность к Фильтрации.Для соблюдения условий, имеющихсяв месте применения, растворы испытывают, . с одинаковой вязкостью (а нес одинаковой концентрацией).Испытания осуществляют в следующих условиях; температура 30 Сход 22,5 мл/ч; фильтры марки Мроге диаметром 47 мм, с диаметпор 3, 8 и 12 мкм,Приготовление растворов. Суводится в содержащей соли воде(50 г/л МаС 1 и 5 г/л СаС 1 ) так,чтобы полученный раствор имел вязкость 35 мПа с (измеряется вискозо 50метром Брукфилда с приставкой БЬ при30 С, степень сдвига 7,3 сПотеря давления Р измеряется,когда 350 мл раствора оказываются отфильтрованными. Если давление превышает 50 мбар, число в скобках указывает объем раствора, который был профильтрован при достижении давления50 мбар. Испытание впрыскивания при постоянном давлении позволяет установить свойства впрыскиваемости разведенных растворов биополимера, Принцип заключается в том что растворы под постоянным давлением пропускают через калиброванный фильтр, Истекающий в зависимости от времени объем характеризуе: впрыскиваемость.Испытание проводят в следующих условиях: фильтры марки М 11 троге диаметром 47 мм с диаметром пор 0,8- 8 мкм; давление 3 бар, приготовление растворов идентично приготовленио растворов в испытании на фильтруемость с постоянным расходом. Вязкость рав" на 35 мПас (Брукфилд с приставкой 111 30 С; 7, с ),Фиксируют время, израсходованное н: протекание 1000 мл раствора. Если это время преьосходит 10 мин, величина в скобках указывает объем раствора, который был профильтрован.П р и,.м е р 3. Влияние энзимати-. ческой обработки на впрыскиваемость разведенных растворов, полученных из порошка ксантановой смолы, который был осажден из обработанного сусла.Из сусла, обработанного Новозимом .234 по примеру 2, выделяют биополимер посредством осаждения с помощью изопропанола, Волокна промывают, сушат и перемалыза 1 от.1429938 10 Таблица 3 Испытуемый раствор Впрыскиваемость при постоянном давлении 3 бар - времядля прохождения 1000 мл раствора с 35 мПа с через приоритетные фильтры, мкм 0,8 Волокна необработаного сусла О 0 ми 220 мл) (905 мл) Волокна сусла,обработанногоНовозимом 234 19 с 10 мин(580 мл 1 ми 52 с мер 4, 2держащего1 кг смольв течение П р кг бродильного,6 г ксантенонотермически обрамин при 100 С оде 11 агп 1 р В 1 епс 1 ег так, чтобы вязкостьполученного раствора была равна35 мПас, а концентрация солей 50 г/лЮаС 1 и 5 г/л СаС 1 сусла, со 15 й смолы на 1 убатывают 15рН 5,5.К 5 кг обработанного и охлажденно-.Ого до 40 С сусла добавляют 1 г Ново" зим 234 и выдерживают раствор в теочение 10 ч при 40 С. Сусло затем концентрируют посредством ультрафильтрации на УРР 2 (торговая марка ирмы "Рон-Нуленк Решерш"), снабженной мембранными, фильтрами ППЯ 3038 А из акрилонитрила с фильтрующей поверхностью 0,022 м . Сусло концентрируется до содержания 80 г на 1 кг сусла.Отбирают 100 г сусла для испытания на нпрыскинаемость при постоянном раКаждый из этих растворов подвергается тесту впрыскивания при постоянном давлении, описанному в предыдущем примере. Результаты представлены в табл.З. Оставшееся сусло промывают известным способом (диафильтрация) прио55 С проточной водой н количестве, в 5 раз превьшающем нес сусла, на том же аппарате, а затем вновь концентрируют до 80 г/кг. По мере промывки конечная концентрация азота в оставшемся веществе уменьшается, достигая в конце операции 20% от начального содержания. Результаты теста на нпрыскиваемость с постоянным расходом представлены в табл, 4 в сравнении с суслом,которое концентрировалось посредством ультрафильтрации беэ термическойобработки и беэ энэиматической обработки (контрольная проба),12 1429938 Таблица 4 Испытуемый раст- вор Вид сусла язкость, 3мПа с Концентрация,м,д,35 44 815 Концентрация на УГ(22,5 мл) 1,7 12,35,3 37 1,8 11,4 35,1 37,2 750 Т а б л иц а 5 Образец ОптичесВязкость ильтрумость,мл/5 мин 73 сс кая 14 с плотностьпри660 нм Не обработанный со сдвигом 0,55беэ сдвига 0,6 200 3,6 120 3,5 3,2 ОбработанныйАлкалас со сдвигом 0,030 11000,033 540 3,3,15 без сдвига 3,5 3,15 Обработано Новозимом234, концентрация на 11 Р 815 Обработано Новозимом234, концентрация на11 Р; диафильтрация П р и м е р 5. Для определения эффект ности комплексного ферментного 25 препарата Новозим 234 по сравнению с ферментным препаратом Киталаэя используется ксантановая. смола Кильзан,Ксантановую смолу разводят в воде, содержащей соли, перемешивая при 25 С дляполучения ксантанового раствоОра 6000 ч. на млн, Добавляют 25 ч, на млн Алкалазы или 25 ч. на млн Но- возима 234. Раствор, содержащий Новозим доводится до рН 6 (рН, способст вующий ферментной активности), Каждая смесь перемешивается при 25 С в течение 4 ч. фильтруемость при постоянномрасходе - ЬР, мбар, при диаметре пор., мкм В конце обработки часть растворов подвергают усилиям сдвига в соплах при 5 Р порядка 30 бар. Каждый образец разбавляют водой 11 ЯВВ для ксантановой концентрации 300 ч. на млн. Измеряют оптическую плотность, Фильтруемость определяется на фильтре 1,2 мм путем измерения количества раствора, отфильтрованного на 5 мин при давлении 1,4 бар. Вязкость измеряется прибором Брукфилда,Результаты испытаний представленыв табл.51429938 13 Продолжение табл.5 Образец фильтру"емость,мл/5 мнн Вязкость птичесая 73 с14 с отстьи нм Обработаннь 0,007 0,003 7 о сдвиго беэ сдвиг 3,2 Форму зоб ени Способ обработки содержащей полисахарид культуральной жидкости ХапЫ 1 о шопаэ сашрей 1 гьэ, предусматривающий введение в нее комплексного фермент- ного препарата, обладающего целлюлозблитической,=1,3-глюконазной и п отеазной активностями, с последующйм инкубированием, о т л и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повыше,ння качества обработки за счет улучшения физико-химических свойств растидык орректор В Гирня Заказ 5148/5 8 Тираж 520ВНИИПИ Государственногопо делам изобретений113035, Москва, Ж, Рауш Подписомитета СССРоткрытийая наб., д. 4/5 предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная,Редактор В,Петраш Техр 1 роизводственно-полиграфическо вора, в качестве комплексного фер -.,ментного препарата используют Новоь20 зим 234, обладающий дополнительноМ,-1,3-глюконазной активностью, кото 1 рый вводят в количестве О,1"3 мас.7в расчете на 0,15-30 мас.% полисахарида культуральной жидкости, приэтом инкубирование осуществляют прио30-60 С в течение 4-14 ч, а передвведением ферментного перпарата накультуральную жидкость предварительоно прогревают при 60-100 С в течение5-60 мин и устанавливают при 3,5-6,2.