Способ стабилизации декстраназы реniсilliuм funiсulоsuм

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 1 ц 968069(51) М. Кл.зС 12 И 9/46 С 12 Х 9/96 Гееударствекнмй камитет СССР пф делам навбретений и етврмтий(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ДЕКСТРАНАЗЬ РЕЫС 1 Ш 1.1 М НЗМ 1 СШ.ОЯЗМ+ф стабилизиз в составе разом, ионы Мп+ф, Са+ф и Мдруют и активируют декстрана узубных паст 2.Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ стабилизации декстраназы Реп 1 с 1111 цгп Ъп 1 сц 1 озцт, основанный на использовании стабилизирующих добавок путем сорбции фермента на бентоните при рН 3,5 - 4,5 с последующей промывкой и элюцией фермента с сорбента при рН 8,0 - 8,2 0,1%-ным растворомстабилизатора, в качестве которого используют полиглюкин или продукт его гидролиза,глюкозу, мальтозу, лактозу, маннит или сульфат аммония. Полученный элюат лиофилизируют в присутствии стабилизатора (приконцентрации последнего 0,2%).Бентонит обычно используют в количестве 2 - 3%,В качестве исвора обычно исцентрат, получета сульфатом амной жидкости Рещим перераствоНедостаткомся то, что препар к микробиологи может быть ис и получении пре Изобретение относитсяческой промышленности ипользовано в медицине прпаратов декстраназы.Декстраназы применяются в стоматологии для профилактики кариеса зубов, для получения клинического декстрана путем частичного гидролиза высокомолекулярного декстрана, а также для изучения структуры полисахаридов, содержащих в своем составе -1,6 гликозидные связи.1 ОИзвестны способы стабилизации декстраназы, входящей в состав зубной пасты, зубных порошков, путем внесения стабилизирующих добавок, например желатины и пептона в количестве 0,3 - 3%. Добавление этих стабилизаторов сохраняло активность 15 фермента на 80 - 89% в течение 3 мес хранения при температуре 30 С 1.Известен также способ стабилизации декстраназы путем добавления стабилизаторов-активаторов декстраназы в виде солей МдС 1 г, которые вносят в пасты в количестве 0,1 - 0,3%. При этом фермент сохраняет свою активность на 86% в течение 9 мес. Добавление солей МпС 1 г и СаС 1 г активирует фермент в 5 - 14 раз. Таким обходного ферментного растпользуют ферментный коннный осаждением ферменмония (70%) из культуральп. 1 цпсц 1 ояпп с последуюрением осадка в воде 2. известного способа являетат очищенной декстраназы,3полученный после десорбции ее с глины и лиофилиэации в присутствии углеводов, добавляемых в известном способе для сохранения активности при лиофилиэации, оказывается недостаточно стабильным при длительном хранении. При хранении такого препарата в течение 12 мес наблюдается потеря активности на 30 - 50%.Целью изобретения является удлинение сроков хранения декстраназы без потери активности.Указанная цель достигается тем, что согласно способу стабилизации декстраназы Реп. Ьп 1 сц 1 озцв; который предусматривает сорбцию фермента на бентоните при рН 3,5- 4,5, отличительным признаком которого является то, что полученный сорбат обрабатывают 10 - 25/о-ным раствором этанола в воде.Бентонит обычно используют в количестве 2 - 3/ОСпособ осуществляется следующим образом.Раствор декстраназы, например в воде, полученный из культуральной жидкости Реп, Ьп 1 сц 1 озшп после концентрирования и осаждения сульфатом аммония и растворения осадка в воде, обрабатывают бентонитовой глиной в количестве 2 - Зо/о. Глину с адсорбированной на ней декстраназой отделяют от раствора и промывают водным раствором этанола, концентрация которого составляет от 10 до 25 О/О. Глину с ферментом отделяют от избытка водного спирта и помещают на хранение в герметически закрытую тару. Измерение сухого остатка, проведенное методом доведения до постоянного веса, показало, что он составляет 40 - 50/о от веса влажного материала, заложенного на хранение,Фермент сохранял полную активность только при хранении его в адсорбированном состоянии в присутствии влаги в герметически закрытой таре, Определение количества влаги показало, что оно составляет 50 - 60 О/о, Установлено, что длительность хранения существенным образом зависит от стабилизирующих добавок. Всего испытано 14 составов смесей (таблица), указанных в примерах, и найдено, что добавки этанола наилучшим образом влияют на стабильность декстраназы при хранении. Одинаково положительные результаты получены для концентраций этанола 10 и 25 О/О. Срок храненияфермента в сорбированном состоянии составил 1 год без потери его активности.Примеры 1 - 14. К 260 мл раствора декст 5 раназы Реп, 1 цп 1 сц 1 озшп с активностью136 ед/мл добавляют 7,8 г (Зо/,) глины Аскангель, устанавливают рН - 4,0 добавлением нескольких капель 50 О/,-ной уксусной кислоты, Смесь перемешивают 2 ч. Глину отделяют от раствора центрифугированием, супернатант содержит 22,4/, активности,не адсорбированной на глине, Глину с остав.шимся на ней ферментом (77,6% от исходной активности) промывают водным раствором разных веществ названия и концентрации веществ приведены в таблице). Промывание осуществляют следующим, образом. Кодному грамму влажной глины прибавляют10 мл водного раствора стабилизирующейдобавки рН 4,5, перемешивают 1 мин, смесьцентрифугируют в течение 5 мин при20 6000 об/мин, сунернатант отбрасывают, авлажную глину с ферментом помешают в полиэтиленовую пробирку, плотно закрываютрезиновой пробкой для герметизации.Через 12 мес.хранения во всех пробах былопределен сухой вес глины с адсорбированной на ней декстраназой и определена активность фермента в пересчете на сухую глину. Данные приведены в таблице.Для сравнения был приготовлен препаратпо известному способу и оставлен на хране 30 ние. Активность в этом препарате через12 мес хранения составляла 60/о от исходной,Из таблицы видно, что в составах, где вкачестве стабилизатора присутствует эти-ловый спирт в количестве 10 и 25 О/о (пример1, 2, 4 и 8) активность фермента сохраняется значительно лучше, чем в смесях, где стабилизаторы используются без добавленияспирта (пример 5, б, 9 и 10). При обработкеглины с адсорбированным на ней фермен 40 том 10 и 25%-ным этанолом активностьдекстраназы сохраняется.полностью в течение 12 мес хранения.Технико-экономическая эффективностьпредлагаемого способа заключается в том,что он позволяет повысить сроки хранения45 без потери активности от 6 до 12 мес.15аП 3 фой а 5сс 3 аОЩ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1111 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 Ъ1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1м ю сч л Ю -3 Ю П с Ю сч -т сс сО сч Щ о СО -П л о 33 о й 5 с л 1 1 О П а с с 5 Х О й ПО с ю с ОО О 1 -3.968069 формула изобретения Составитель О. Скородумова Редактор Г. Волкова Техред И. Верес Корректор А. Гриценко За каз 7259/40 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 41, Способ стабилизации декстраназы Реп 1 с 1111 цт 1 цп 1 сц 1 озцгп, предусматриваюший сорбцию фермента на бентоните при рН 3,5 - 4,5, отличающийся тем, что, с целью повышения срока хранения фермента без снижения активности, полученный сорбат обрабатывают 10 - 25%-ным водным раствором этанола.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бентонит используют в количестве 2 - 3% 8Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент США3981989, кл. 424-50,1976.2. Патент США3991177, кл, 424-50,5 1976.3. Максимов В. И Данилова Т, И, Хасирджева А, К. и Молодова Г. А. Стабилизацияпрепаратов декстраназы Реп. Ьп 1 сц 1 озцгп иРцзапцв зо 1 ап 1 при нагревании и лиофилизации. Прикладная биохимия и микробиоло 1 О гия, 1979, ХЧ, вып. 6, 846 - 851.