Способ культивирования хлореллы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН НЯО 3728 А 2, А 01 Н е 4 С БРЕТЕНИ ИСАНИ Ь,Ь 1 Б,ЕТЕЛЬСТ К АВТОРСК ОРЕЛЛЬ 1 бласти су19са5 ельюе приГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(71) Научно-производственное обьединение по продуктам питания из картофеля и Институт фотобиологии АН БССР(56) Ляхнович Я.П., Колешко О.И. Квопросу использования соковых водв смешанных культурах бактерий ихлореллы. - Физиолого-биологическиеисследования растений. Минск, Наукаи техника, 1967, с. 21-26.(54) СПОСОБ КУЛЪТИВИРОВАНИЯ ХЛ(57) Изобретение относится к опромышленной микробиологии. Цизобретения является повышенироста биомассы хлореллы при одновреном снижении энергоэатра культивирование и удешевление биомассы. Способ состоит в том, что хлореллу выращивают на питательной среде,содержащеи минеральные соли и жидкие отходы, образующиеся при варке и бланшировке картофеля на картофеле- перерабатывающих предприятиях, с содержанием сухих веществ 1-1,57, при следующем соотношении компонентов, г/л; азотно-кислый калий 0,2-0,5, одноэамещенный фосфорно-кислый калий 0,06-0, 12, фильтрат жидких отходов, образующихся при варке и бланшировке картофеля, остальное, а культивирование ведут при освещенности 4 5 тыс.лк. Способ позволяет получитьспензию хлореллы с плотностью 3,75 млн. клеток/мл (сухая биомас 4,52 г/л) при освещенности 4тыс.лк3 табл.Изобретение относится к промышленной микробиологии и может бытьприменено для культивирования фотоавтотрофных водорослей, напримерхлореллы,Цель изобретения - увеличение выхода и удешевление процесса.Поставленная цель достигаетсятем, что питательная схема для культивирования хлореллы, содержащаяазотно-кислый калий, одноэамещенныйфосфорно-кислый калий и картофельноесырье, в качестве картофельногосырья содержит фильтрат жидких отхо гдов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, при следующем соотношении компонентов, г/л;Азотно-кислый калий 0,2-0,5Однозамещенный фосфорно-кислый калий 0,06-0,12Фильтрат жидких отходов, образуемых приварке и бланшировкекартофеля Остальное до 1 л 25При этом фильтрат жидких отходов,образуемых при варке и бланшировкекартофеля, содержит 1 - 1,5 ь сухихвеществ,Фильтрат указанных жидких отходов 30имеет следующий физико-химическийсостав: углеводы растворимые 0,0160,024, крахмал 0,69-1,035, минеральные вещества 0,027-0,041, азотистыевщева 0,016 0,024, белклетчатка 0,033-0,006, жиры 0,0040,006, прочие 0,016-0,024.Культивирование осуществляют приосвещенности 4-5 тыс. лк,Предлагаемую питательную среду 40готовят следующим образом. Для приготовления фильтрата жидкие отходы, образуемые при варке и бланшировке картофеля, направляют 45 в емкости, отстаивают в течение 20- 30 мин, после чего надосадочную жидкость отфильтровывают с получением фильтрата с концентрацией сухих веществ 1-1,57 50В 100 мл полученного фильтрата вносят 0,2-0,5 г азотно-кислого калия и 0,06-0,12 г однозамещенного фосфорно-кислого калия и тщательно перемешивают, после чего доливают укаэанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза через сутки при 0,2 атм в течение 30 мин,Приготовленную таким образом питательную среду переливают в сосуды и засевают маточной культурой СЬ 1 оге 1- 1 а чи 18 агдэ в таком количестве, что" бы исходная концентрация составляла 10 10 клеток/мл суспенэии. Культибвирование микроводоросли ведут при 22-24 С, освещенности 4-5 тыс. лк и чередовании светового и темнового периодов 12:12 ч. В течение светового периода культуру перемешивают. Выход биомассы хлореллы составляет 4,22- 4,52 г/л сухой биомассы или 186,0- 193,7 млн.клеток/мл суспенэии.П р и м е р 1. Для приготовления фильтрата жидкие отходы, образуемые при варке и бланшировке картофеля, направляют в емкости, отстаивают в течение 30 мин, после чего надосадочную жидкость сливают и пропускают через фильтр с получением фильтрата с концентрацией сухих веществ 17.В 100 мл полученного фильтрата жидких отходов вносят 0,5 г азотно- кислого калия и 0,06 г однозамещенного фосфорно-кислого калия и тщательно перемешивают, после чего доливают указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза через сутки при 0,2,атм в течение 30 мин.Приготовленную таким образом питательную среду переливают в сосуды и засевают маточной культурой СЬ 1 оге 11 а чц 1 раг 1 з в таком количестве, чтобы исходная концентрация составляла 1010 кл/мл суспензии, Культивирование6микроводоросли ведут при 22 С, освещенности 4 тыс, лк и чередовании светового и темнового периодов 12:12 ч.В течение светового периода культуРу перемешивают воздухом, Выход биомассы составляет 4,22 г/л при 186,010 б клеток/мл суспенэии.П р и м е р 2. Для приготовления фильтрата жидкие отходы, образуемые при варке и бланшировке картофеля, направляют в емкости, отстаивают в течение 25 мин, после чего надосадочную жидкость сливают и пропускают через фильтр с получением фильтрата с концентрацией сухих веществ 1,37В 100 мл полученного фильтрата жидких отходов вносят 0,2 г аэотнокислого калия и О, 12 г одноэамещенного фосфорно-кислого калия и тщательно перемешивают, после чего указанный фильтрат доливают до общего объема1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза через сутки при 0,2 атм в течение 30 мин,Приготовленную таким образом пи 5 тательную среду переливают в сосуды и засевают маточной культурой СЬ 1 оге 1- 1 а чи 18 агз в таком количестве, чтобы исходная концентрация составляла 10 10 клеток/мл суспензии. Культиьвирование микроводоросли ведут при 23 С, освещенности 4,5 тыс.лк и чередовании светового и темнового периодов 12:12 ч, В течение светового периода культуру перемешивают, Выход 15 биомассы составляет 4,39 г/л или 188,25 10 клеток/мл суспензии.: П р и м е р 3. Для приготовления фильтрата жидкие отходы, образуемые при варке и бланшировке картофеля, 20 направляют в емкости, отстаивают в течение 20 мин, после чего надосадочную жидкость сливают и пропускают через фильтр с получением фильтрата с концентрацией сухих веществ 1,5 Е. 25В 100 мл полученного фильтрата жидких отходов вносят 0,3 г азотно- кислого калия и 0,08 г однозамещенного фосфорно-кислого калия и тщательно перемешивают, после чего доливают 30 указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза через сутки при 0,2 атм в течение 30 мин.Приготовленную таким образом пи 35 тательную среду переливают в сосуды и засевают маточной культурой СЬ 1 оге 1- 1 а чц 18 агдз в таком количестве, чтобы исходная концентрация составляла 1 О 10 клеток/мл суспензии. Культи6вирование микроводоросли ведут пои температуре 24 С, освещенности .5 тыс, лк. и чередовании светового и темнового периодов 12:12 ч. В течение светового периода культуру пе ремешивают. Выход биомассы составляет 4,52 г/л или 193,75 10 клеток/мл сус 6суспензии,П р и м е р 4. В 100 мл полученного 1,5 Е-ного фильтрата жидких отходов вносят О, 1 г азотно-кислого калия и О, 12 г однозамещенного фосфорно-кислого калия и тщательно перемешивают, после чего доливают указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза через сутки при 0,2 атм в течение 30 мин,Приготовленную таким образом питательную среду переливают в сосуды изасевают маточной культурой СЬ 1 оге 11 ачи 1 рагдв в таком количестве, чтобыисходная концентрация составляла 10 "10 клеток/мл суспензии. Купьтивиьрование микроводоросли ведут по примеру 3, Выход биомассы составляет3,97 г/л или 170,25 10 клеток/млсуспензии,П р и м е р 5. В 100 мл полученного 1,33-ного фильтрата жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, вносят 0,6 газотно-кислого калия и 0,1 г однозамещенного фосфорно-кислого калия итщательно перемешивают, после чегодоливают указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробнойстерилизации 3 раза через .сутки при0,2 атм в течение 30 мин.Приготовленную таким образом питательную среду переливают в сосудыи засевают маточной культурой СЬ 1 оге 11 а чц 18 агв в таком количестве,чтобы исходная концентрация составляла 10 10 клеток/мл суспензии, Куль 6тивирование микроводоросли ведут попримеру 3, Выход биомассы составляет4,48 г/л или 192 О клеток/мл суспензии.П р и м е р 6, В 100 мл 1,3/-ного фильтрата жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, вносят 0,5 г азотно-кислогокалия и 0,05 г однозамещенного фосфорно-кислого калия, тщательно перемешивают, после чего доливают указанный фильтрат до общего объема 1 ли подвергают дробной стерилизации3 раза через сутки при 0,2 атм в течение 30 мин.Засев маточной культуры СЬ 1 оге 11 ачц 18 агв на приготовленную питательную среду и культивирование микроводоросли осуществляют по примеру 2.Выход биомассы составляет 4,01 г/лили 172,0 10 клеток/мп суспензии,П р и м е р 7. В 100 мл 1,5 Е-ного фильтрата жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, вносят 0,5 г азотно-кислого калия и О, 13 г однозамещенного фосфорно- кислого калия, тщательно перемешивают, после чего доливают указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 ра 1373728за через сутки при 0,2 атм в течение30 мин,Засев маточной культуры СЬ 1 оге 11 ачц 18 аг 1 э на приготовленную питатель 5ную среду и культивирование микроводоросли осуществляют по примеру 3,Выход биомассы составляет 4,46 г/лили 191,25 10 клеток/мл суспензии.П р и м е р 8. В 100 мл 0,097-ного фильтрата жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, вносят 0,5 г азотно-кислого калия и 0,12 г однозамещенного фосфорно-кислого калия, тщательно перемешивают, после чего доливают укаэанныйфильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 разачерез сутки при 0,2 атм в течение30 мин. 20Засев маточной культуры СЛ 1 оге 11 ачи 1 рагдз на приготовленную питательную среду и культивирование микроводоросли осуществляют по примеру 1,Выход биомассы составляет 3,76 г/лили 161, 12 10 клеток/мл суспензии.П р и м е р 9. В 100 мл 1,67 в ного фильтрата жидких отходов образуемых при варке и бланшировке картофеля, вносят 0,5 г азотно-кислого калияи О, 12 г однозамещенного фосфорнокислого калия, тщательно перемешивают,после чего доливают указанный фильтрат до общего объема 1 л и подвергают дробной стерилизации 3 раза черезсутки при 0,2 атм в течение 30 мин.Засев маточной культуры СЬ 1 оге 11 ачц 18 агдз на приготовленную питательную среду и культивирование микроводоросли осуществляют по примеру 3.40Выход биомассы составляет 4,08 г/лили 175,0.10 клеток/мл суспензии,ь фильтрат жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофе ля, представляет собой светлую полупрозрачную жидкость - суспензию,содержащую ряд ценных питательных веществ - источников углерода и азота, в том числе крахмал, белок, сахара,50 незаменимые аминокислоты, а также микроэлементы и биологически активные вещества. При этом осуществление процессов бланшировки и варки приводит к термическому гидролиэу содержащихся в фильтрате органических веществ, что, как показали исследования, обуславливает их лучшую усвояемость хлореллой и тем самым способствует ее лучшему развитию и большему накоплению биомассы и хлорофилла.Исследования показали, что фильтрат жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля предлагаемой концентрации в сочетании с азотно-кислым и однозамещенных фосфорно-кислым калием, взятыми в предлагаемых количествах, является оптимально сбалансированным питательным субстратом для культивирования хрореллы.Граничные значения каждого компонента, вводимого в предлагаемую питательную среду, определяли эмпирически путем подбора компонентов и испытания вариантов среды.Данные по продуктивности культуры хлореллы, в том числе накоплению клеток и сухой биомассы на предлагаемой питательной среде в соответствии с примерами 1-9 (т.е. при заявляемых и запредельных количествах вносимых компонентов), а также на известной среде и среде Тамия, приведены в табл. 1,Как видно из табл. 1 (примеры 1-3), предлагаемые пределы содержания компонентов являются оптимальнЫми и обуславливают сбалансированность среды по питательному составу, что способствует активному накоплению биомассы хлореллы. Продуктивность хлореллы при ее культивировании на предлагаемой питательной среде увеличивается на 29-337. по сравнению с известной средой в 1,7-1,8 раза по сравнению со средой Тамия.Введение в питательную среду азотно-кислого калия в количестве менее 0,2 г/л нежелательно, так как приводит к недостаточности азотного питания, что вызывает снижение продуктивности хлореллы (пример 4), а его введение в количестве более 0,5 г/л нецелесообразно, так как не приводит к улучшению достигаемого эффекта (пример 5).Введение в питательную среду однозамещенного фосфорно-кислого калия в количестве менее 0,06 г/л приводит к нарушению сбалансированности среды по фосфору, что также вызывает снижение продуктивности хлореллы (пример 6), а его введение в количестве более О, 12 г/л нецелесообразно, так как приводит к излишнему расходу компонен 1373728та без повышения прироста биомассы хлореллы (пример 7).Исследования показали, что при использовании фильтрата жидких отходов, образуемых при варке и бланшировке картофеля, с концентрацией сухих веществ менее 17, не обеспечивается потребность хлореллы в углеродном и азотном питании, вследствие чего сни жается ее продуктивность (пример 8), а использование фильтрата с концентрацией выше 1,57 нецелесообразно,так как приводит к снижению фотосинтетической активности хлореллы вследствие 1 г уменьшения светопроницаемости фильтрата,Светлый цвет и полупрозрачность предлагаемой питательной среды по сравнению с известной средой в сочетании с более богатым и лучше усвояемым органическим составом обеспечивают повышение прироста биомассы и хлорофилла в условиях пониженной освещенности. 20 25 Как видно из табл, 2, обеспечение нормальной фотосинтетической активности хлореллы при культивировании ее З 5 на предлагаемой питательной среде достигается при освещенности в 2-4 разе меньшей по сравнению с известной средой, что обуславливает снижение энергозатрат соответственно на 226,5- 40 453 кВт ч электроэнергии на 1 т суспензии хлореллы.Сравнительные данные по приросту клеток хлореллы и накоплению в них Данные, отражающие потребность в освещенности при культивировании хлореллы на предлагаемой питательной среде по сравнению с известной средой 30 приведены в табл. 2. хлорофилла на различных питательныхсредах представлены в табл. 3.Как видно иэ табл. 3, использование предлагаемой питательной средыстимулирует работу фотосинтетическогоаппарата водоросли вследствие большего накопления хлорофилла по сравнениюс известной средой и средой Тамия,что в свою очередь обеспечивает больший прирост биомассы как сухой, таки по количеству клеток,Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить прирост биомассы хлореллы при одновременном снижении энергозатрат на ее культивирование и снизить затраты на производство биомассы, что обуславливает технико-экономическую эффективность.Формула изобретенияСпособ культивирования хлореллы, включающий культивирование ее на питательной среде, содержащей азотнокислый калий, однозамещенный фосфорно-кислый калий и картофельное сырье при освещении в оптимальных условиях до максимального накопления биомассы, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и удешевления процесса, в качестве картофельного сырья используют фильтрат жидких отходов, образующихся при варке и бланшировке картофеля, с концентрацией сухих веществ 1-1,52 при следующем соотношении компонентов, г/л:Азотно-кислый калий 0,2-0,5Одноэамещенный фосфорно-кислый калий 0,06-0,12Указанный фильтратжидких отходов Остальное а культивирование осуществляют при освещенности 4-5 тыс,лк., 4,52 0,08 0,1 170,25 3,97 0,12 0,6 192,0 4,48 0,1 Питательная среда, г 1 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 17 2 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорно-кислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,ЗЕ 3 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,57,4 Азотно-кислый калий Одноэамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке и бланшировке картофеля с концентрацией сухих веществ 1,57 5 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,5 Х Остальное до 1 л Остальное до 1 л Остальное до 1 л Остальное до 1 л Остальное до 1 л Таблица 1 Прирост биомассы хлореллы Количество Сухая биомасса,млн/клеток/мл г/лсуспенэии12 1373728 Состав 172,0 0,5 4,01 0,05 4,46 191,25 0,5 О, 13 161, 12 3,76 0,5 0,12 4,08 175,0 0,5 0,12 145,0 3,35 107 Остальное 80,5 2,5 1003 1Питательная среда; г 6 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,37 7 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,57. 8 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 0,97 9 Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих веществ 1,67. 10 Известная среда Среда Тамия Соковые воды крахмального производства (бросовыйкартофельный сок) 11 Среда Тамия Остальное до 1 л Остальное до 1 л Остальное до 1 л Остальное до 1 л Продолжение .табл, 1 Прирост биомассы хлореллы Количество Сухая биомасса,млн/клеток/мп г/лсуспенэии4 13 1373728 Таблица 2 Прирост биомассы в млн.кл/мл Освещенность,в тыс. лк 1 Известная 145 16 103 Среда Тамия Остальное 140 2 То же 31 Роста не наблюдалось 0,3 0,08 186,0 Таблица 3 КоличестОсвещенСосностьтыс.лк тав 1002 90,5 88,15 103 145,0 20, 09 Остальное 0,3 0,08 193,75 108,9 Остальное до 1 лСос- Питательная среда, гтав Соковые воды крахмальногопроизводства (бросовый картофельный сок) 4 Предлагаемая Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеля сконцентрацией сухих вевеществ 1 Ж Питательная среда, г 1 Среда Тамия 2 ИзвестнаяСреда Тамия Соковые воды крахмального производства 3 Предлагаемая Азотно-кислый калий Однозамещенный фосфорнокислый калий Фильтрат жидких отходов,образуемых при варке ибланшировке картофеляс концентрацией сухихвеществ 1,57 Остальное до 1 л во млн клеток/мл суспензии Хлорофилл (а+В),мг/л суспензии