Способ получения лимонной кислоты глубинным методом

.(54 С 85 12 всюсцоз-1 ЙАГЪГ) л,1 ЕХМцг(- ., ,3фИИЯЯю 4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЕТЕЛЬСТ АВТОРСКОМ левои ститут ова,СР 63 ЛИМО ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(56) Авторское свидетельстИ 659609, кл. С 12 Р 7/48,Авторское свидетельствоУ 153707, кл. С 12 Р 7/48,(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ННОИ КИСЛОТЫ ГЛУБИННЫИ МЕТОДОМ, включающий посев спор гриба-продуцентаАзрег 8111 оз пЦег в условиях аэрации и перемешивания в посевнойферментатор, подращивание на мелассном растворе кислотообразующегомицелия, ферментацию на меласснойсреде в основном ферментаторе ивьщеление лимонной кислоты, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, для подращивания мицелия используютмелассный раотвор с концентрациейсахара 4,5-6,0%, при этом подращивание ведут в течение 24-36 ч дляферментации используют меласснуюсреду с концентрацией сахара 13-14%,ферментацию проводят в течение 4,55,5 сут а на вторые и третьи суткиферментации проводят долив стерильнойводы в количестве 4-5% от объемасреды, причем в качестве гриба-продуцента используют Азрегях 11 цзаЦег Л,2. Способ по п, 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью создания оптимальных условий для ферментации при использовании меласс ссодержанием кальция свьппе 0,8%,в.мелассную среду вводят щавелевокислый аммоний в количестве, необходимом для осаждения 1/2 солей кальция,содержащихся в мелассе, и сернокисльжцинк в количестве 10-17 мг на 1 лмелассной среды, при этом общееколичество мелассной среды берутисходя из заполнения объема основного ферментатора на 70-75%.Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к технологии получения пищевых органических кислот, в частности лимонной. кислоты, способом глубинной ферментации угле- ,5 водсодержащего сырья, например мелассы, погруженной культурой микроорганизма - продуцента лимонной кислоты.Цель изобретения - повьппение выхода лимонной кислоты и создание 1 О .оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьппе 0,87.Способ осуществляют следующим образом. 15Посевной мицелий в течение 24- 36 ч выращивают на среде из мелассы, содержащей 4,5-6% сахара, в одну стадию: для ферментации подготавливают мелассную среду с начальной 20 концентрацией сахара 13-14%, В качестве ингибитора образования побочных кислот применяют сернокислый цинк в дозе, соответствующей 10-17 мг на литр среды. Объем заполнения фер ментатора 70-5%. Увеличение концентрации свыше 67. приводит к непроизводительному расходу сахара, дополнительным затратам сырья. Умеиьше" ние концентрации ниже 4,5% настолько З 0 увеличивает период адаптации грибапродуцента в результате резкого перепада концентрации питательных веществ при переводе подрощенного мицелия в ферментированные растворы, что процесс становится нерентабельным.Использование мелассной среды с высокой концентрацией сахара и одновременное заполнение объема ферментатора на 70-57 позволяет использовать в одном цикле (без дополнительных подливов) до 7,5 т мелассы и, следовательно, получить высокий валовый выход лимонной кислоты с ферментатора. При использовании концентрированных мелассных сред, когда весь запас питательных веществ дается сразу, процесс адаптации и роста гриба происходит с первых суток, а затем идет активный биосинтез лимонной кислоты, увеличение титруемой кислотности без снижения до конца процесса. Для обеспечения нормальной аэрациив ферментаторе эрлифтного типа и фболее полной утилизации субстрата, впроцессе ферментации на 2-е и 3-исутки производят долив стерильной воды в количестве 4-57 от объема ферментатора. Продолжительность ферментации 4,5-5,5 сутНеобходимость доливов стерильной воды вызвана тем, что в результате испарения среды увеличивается вязкость растворов, возрастает концент-, рация продуктов метаболизма гриба, ухудшаются условия питания и газо- обмена. Доливы воды в количес,тве 4-5% от объема среды снимают эти негативные явления и улучшают условия кислотообразования. Выбранное время долива (2-е и 3-и сутки ферментации) наиболее благоприятно, так как именно в этот период в результате нарастания мицелиальной массы и высокой степени аэрации происходит значительное испарение среды и накопление продуктов жизнедеятельности гриба. При более позднем сроке начала доливов происходит снижение технологических показателей процесса. Прозводить долив воды на первые сутки нецелесообразно, так как гриб только начинает накапливать биомассу и любые операции, связанные с доливом, увеличивают вероятность инфицирования среды.В качестве гриба-продуцента используют осмофильный штамм Азрег 1- 1 из пег Л(штамм депонирован в Центральном музее промьппленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером Г).Высокая исходная степень заполнения ферментаторов достигается в результате частичного (1/2) осаждения солей кальция щавелевокислым аммонием. Вследствие этого происходит сравнительно небольшое вспениваниесреды, что позволяет сохранить необходимый уровень заполнения ферментаторана 70-75%. При полном осаждении солей кальция возрастает содержание азота, что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой. Дозировка ЕпБО зависит от используемых образцов мелассы, от доз ферроцианида кальция и щавелевокислого аммония, применяемых для обработки мелассы. Вещества, используемые для осаждения тяжелых металлов и солей кальция, не имеют избирательного действия и в процессе соосаждения выводят из раствора ряд необходимых микроэлементов, в том числе и Еп, Экспериментально: установлено, чтоЕп 801, применяемый в дозе 10-17 мг на лйтр мелассной среды, дает возможность направить биосинтез в сторону максимального продуцирования лимонной кислоты за счет угнетания биосинтеза глюконовой кислоты при ферментации яелассных сред.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Выращивание кислотообразующего мицелия и синтез лимонной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке типа АВУр с числом качаний 160 в минуту в колбах емкостью 700 см прио32 С. В качестве продуцента использовали Аврегу 11 цз пает штамм Л.Для подращивания мицелия приготавливали мелассную среду, содержащую 5% сахара по следующему рецепту, г/л:Меласса 106,4ЩавелевокислыйаммонийФерроцианид калияОднозамещенныйФосфат калия 0,16Углекислый натрийбезводный 0,146Сульфат цинка водный 0,005Сульфат магния водный 0,25Готовую стерильную среду разливали в качалочные колбы по 50 мл и засевали суспензией конидий. Для приготовления суспензии 15 мг конидий замачивали в 10 мл мелассной среды, приготовленной для подращивания, и интенсивно стряхивали в течение 5 мин. Подращивание мицелия проводили 24 ч.Для Ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 13 сахара следующего состава, г/л:Меласса 276,0Ферроцианид калия 0,9Углекислый натрийбезводный 0,38Однозамещенный фосфаткалияСульфат цинка водный 2,11 0,35 е 3П р и м е р 2, Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 1. Процесс ферментацни отличается от примера 1 тем, что приготавливаемый мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым аммонием в количестве, необходимом для осаждения половины солей кальция (из0,38 15 0,38 расчета содержания Саф в мелассе впересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отношению к оптимальной дозе, установленной для разбавления сред, используемых в известном способе.Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:Меласса 276,0Ферроцианид калия 0,9Углекислыи натриибезводныиЩавелевокислыйаммонии 2,73Однозамещенныйфосфат калия 0,16Сульфат цинкаводный 0,010 20 Результаты испытаний даны втабл. 1.Данные табл. 1 показывают, чтопри ведении процесса по предлагаемойтехнологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастаетна 18,7 , а выход от сахара на 5,7%по сравнению с прототипом.П р и м е р 3. Процесс подращивания посевного мицелия осуществлялитак же, как в примере 2. Процессферментации отличается от примера 2тем, что приготовленный мелассныйраствор обрабатывали щавелевокислым,аммонием в количестве, необходимомдля полного осаждения солей кальция 35 (из расчета содержания Са+ в мелассе в пересчете на СаО). Одновременноувеличивали в 2,0 раза количествовносимого сернокислого цинка поотношению к оптимальной дозе, уста О новленной для разбавления сред, используемых в известном способе.Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:4Меласса 276,0 45 Ферроцианид калия 0,9Углекислый натрийбезводныйЩавелевокислый натрий,безводный 5,46 50 Однозамещенный фосфаткалия 0,16Сульфат цинка водный 0,01Сравнивая данные, полученные приведении процесса по предлагаемой 55 технологии, количество лимонной кислоты, полученное с,колбы, снижаетсяна 10,8%, выход от сахара на 12,4В растворе накапливается 25,8 щаве122 30 0,09 1,26 50 Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии ферментации концент-, рированных сред количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возросло 5левой кислоты, тогда как по прототи пу ее содержание составляет 11,9%, а про предлагаемой технологии щавелевая кислота не синтезируется вообще (табл. 1).5Готовую среду разливали в качалочные колбы по 50 мл и засевали 10 мл подрощенного мицелия, Процесс ферментации длился 5 сут. С колбы получено 5180 мг общей кислоты, в составе 10 синтезируемых кислот лимонная кислота составила 96,37., глюконовая 3,77, щавелевая кислота отсутствовала, выход лимонной кислоты от сахара 71,25%. 15Контролем служил процесс, осуществляемый по технологии прототипа, при котором мицелий производственного штамма Азрег 811 из п 8 ег Лподращивают на мелассной среде, 20 содержащей 3% сахара в течение 24 ч. Подросшим мицелием в количестве 10 мл засевали ферментационную мелассную среду, содержащую ЗЕ сахара. Через 24 ч после засева бродильных 25 растворов подрощенным мицелием начинали доливы мелассного раствора 257-ного по сахару. Доливы проводили в два приема по 9,5 мл через 5 ч.Мелассная среда для подращивания мицелия,г/л:Меласса 63,8Ферроцианид калия 0,21Углекислый натрийбезводный35Щавелевокислый аммонийОднозамещенный фосфаткалия 0,16Сульфат цинка водный 0,005Сульфат магния водный 0,25Для ферментации среда приготавливается по тому же рецепту, что и для подращивания, но не вводят сульфат магния.Мелассная среда для долива, г/л: 45Меласса 532,0Ферроцианид калия 17,7Процесс ферментации длился 5 сут. За процесс с колбы получено 5440 кг общей кислоты, в составе кислот лимонная составляет 79,8%, щавелевая 11,97, глюконовая 8,37, выход лимонной кислоты от сахара 67,27. 1241 6на 13,5%, а выход от сахара на 4,07., при этом в составе синтезируемых кислот отсутствует щавелевая кислота.П р и м е р 4. Процесс подращивания посевного осуществляли, как в примере 1. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелассный раствор 127.-ный по сахару. гРецепт мелассной среды дл ферментации, г/л:Меласса 255,0Ферроцианид калия 0.8Углекислый натрийбезводный 0,35Щавелевокислыйаммоний 2,5Однозамещенный фосфаткалия 0,16Сульфат цинка водный 0,010Из табл. 1 видно, что при ведении процесса по предлагаемой технологии, количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 5,47, а выход от сахара на 2,57.П р и м е р 5. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 1, Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелассный раствор с содержанием сахара 143.Рецепт мелассной среды.для ферментации, г/л:Меласса 298,0Ферроцианид калия 1,0Углекислый натрийбезводный 0,41Щавелевокислый аммоний 2,95Однозамещенный фосфаткалия 0,16Сульфат цинка водный 0,10Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 18,2 ,П р и м е р 6. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 2. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что количество вносимого сернокислого цинка в мелассный раствор равно оптимальной дозе, установленной для разбавленных сред (5 мг/л), Данные табл. 1 показывают, что при такой подготовке сред, усиливается синтез глюконовой кислоты и снижается био108,7 7синтетическая активность гриба, врезультате количество лимонной кислоты, полученной с колбы, возрастаетлишь на 2,7 , а выход от сахараснижается на 4,5 по сравнению спрототипом.П р и м е р 7, Процесс подращивания посевного мицелия и ферментациюосуществляют, как в примере 2(табл. 1). Отличие состоит в том, 1 Очто количество сернокислого цинка,вносимого в мелассную ферментационную среду, увеличивается по сравнениюс оптимальной дозой, установленнойдля разбавленных сред, в 3,4 раза и 15составляет 17 мг/л. При такой подготовке сред гриб активно синтезируеторганические кислоты, причем в основном лимонную кислоту (88,8 ), в результате количество лимонной кислоты 20по сравнению с прототипом возрастаетна 15,5 , а выход от сахара на 3,7(табл. 1).П р и м е р 8. Процесс подращивания посевного мицелия и ферментацию 25осуществляют, как в примере 2. Отличие состоит в том, что количествосернокислого цинка, вносимого в ме-:лассную среду для ферментации, превышает норму, установленную для разбав- ЗОленных сред, и составляет 15 .мг/л.При такой подготовке сред активностьгриба повышается, увеличивается содержание лимонной кислоты в составесинтезируемых кислот, в результатеколичество лимонной кислоты по срав 35нению с прототипом повышается на16,2 , а выход от сахара на 4,5 .(табл. 1),Следовательно, при обработке ме 40лассных сред повышенной концентрацииШКА (в дозе, необходимой для выведения половины солей кальция, содержащихся в мелассе) доза вносимого сернокислого цинка должна быть увели 45чена по сравнению с дозой, установленной для разбавленных сред, исоставляет 10-17 мг/л,П р и м е р 9. Культивирование осуществляли в производственных усло 50 виях. В качестве продуцента использовали осмофильный штамм Азрег 811 из п 8 ег Л. Для подращивания мицелия приготавливали 3 м мелассной среды, содержащей 5 сахара. Состав среды для подращиваниямицелия, г/л: по сахаруЩавелевокислый. аммоний 3,66Ферроцианид калия 0,46Сульфат магния 0,23фосфорнокислый калий 0,116Сульфат цинка,гидрат 0,01Фурациллин 0,017Мелассу разбавляли в 2 м горячейводы в варочном котле и кипятили10 мин. Затем добавляли щавелевокислый аммоний, кипятили 5 мин, вносили ферроцианид калия и кипятилиеще 5 мин. После внесения сернокислого магния раствор через стерилизационную систему подавали в посевнойферментатор емкостью 5 мэ . В мелассный раствор, охлажденный до 38 С,вносили стерильные растворы питательных солей фосфорнокислого калия исернокислого цинка и антисептик фурациллин. Засев среды производиликонидиями гриба в количестве 3 гпредварительно (за 6 ч до посева),замоченных в мелассной среде тогоже состава.Ферментацию проводили в 50 мферментаторе на среде, содержащей13 сахара.Состав среды для ферментации,г/л:Меласса 46 -ная посахару 282,0Щавелевокислыйаммоний 3,33Ферроцианид калия 1,03Фосфорнокислый калий 0,106Сульфат цинка, гидрат 0,02Раствор. приготовленный в 50 мферментаторе, засевали мицелиемгриба Азрегд 11 цз пЦег штамма Л,выросшим в посевном ферментатореза 24 ч.В процессе ферментацчи мелассныйраствор не подливали, В связи с тем,что в процессе ферментации происходит испарение, производят доливстерильной роды дважды по 2-2,5 м,обеспечивая лучшее эрлифтное перемешивание и более полное усвоениесубстрата. В процессе ферментации соблюдали следующий режим аэрации: первые 3 ч на ферментатор подают 200-300 мз в час воздуха, через 3-6 ч 300-600 м в час, через 12 ч 600-800 м в час,1221 25 9через 20 с 800-1000 м в час ичерез сутки 1100-1200 м в час. Наэтом уровне аэрацию сохраняли доконца цикла.Процесс ферментации заканчиваютпри содержании сахара в ферментируемой среде 0,2%. Длительность ферментации 4,9 сут.Контролем служил процесс, осуществляемый по известному способу, 10принятому за прототип, на разбавленных средах, при котором в качествепродуцента применяли производственный штамм Азрег 8111 цв п 1 цег Л,Результаты представлены в табл. 2. 15При ведении процесса по предлагаемой технологии за цикл с ферментатора получено 3014 кг лимоннойкислоты. В составе синтезируемыхкислот содержалось 88,3% лимонной 20кислоты и 11,6% глюконовой кислоты,щавелевая кислота не синтезировалась.Съем лимонной кислоты составил11,2 кг с 1 м в сут, выход лимонной кислоты от сахара мелассы73,6%. Для получения. 1 т лимоннойкислоты затрачено 2952 кг 46%-нойпо сахару мелассы.При ведении процесса по прототипу за 5,0 сут с ферментатора получено 2748 кг лимонной кислоты. Всоставе синтезируемых кислот содержалось 85,9% лимонной кислоты,10,0% щавелевой кислоты и 4,1% глюконовой кислоты. Съем лимонной кислоты с 1 м в сут 10,0 кг, выходлимонной кислоты от сахара мелассы77,4%. На получение 1 т лимоннойкислоты затрачено 2808 кг 46%-нойпо сахару мелассы. 40П р и м е р 10. Процесс осу-,ществляют, как в примере 9, Отличиесостоит в том, что долив стерильнойводы начинают с третьих суток. Порезультатам, представленным в 45табл. 2, видно, что при таком веде 241 10нии процесса по сравнению с прототи-пом сокращается длительность цикла,увеличивается съем лимонной кислоты,однако значительно снижается выходот сахара.П р и м е р 11. Процесс осуществляют, как в примере 9. Отличиесостоит в том, что долив стерильнойводы начинают с четвертых суток, Порезультатам, представленным втабл. 2, видно, что при таком ведении процесса резко ухудшаются всепоказатели процесса как по сравнениюс прототипом, так и в случаях когдадолив стерильной воды начинают на2-3 сут (см. табл. 2, пример 9 и 10) .Таким образом, предложенный способ позволяет ферментировать мелассные среды повышенной концентрации,при этом съем лимонной кислоты с1 м в сутки возрастал на 11,2%.Отсутствие щавелевой кислоты приведении процесса по предлагаемойтехнологии исключает образованиеоксалата кальция при переработке сброженных растворов,вывоз оксалатакальция и связанные с этим транспортные расходы. Ведение процесса бездоливов мелассных растворов уменьшает трудозатраты на стерилизациюподливных емкостей, приготовлениеподливных растворов мелассы и ведение дробных доливав за время ферментации, При этом уменьшается расходводы и пара. Исключение операции подоливу сред уменьшает возможностьпопадания посторонней микрофлоры,в результате чего улучшаются технико-экономические показатели,Применение предлагаемой технологии на проектируемых заводах уменьшает капитальные затраты на оборудование бродильных цехов подливными емкостями и высвобождает производственные площади.М .:СО СО СО л4 лй 0 Ю 0 Ч - - СО В О В 0 О О СО СО СО О О О О О О 1О О Ю О Ю ЮО а а Ю О Ю0 Л Л Л13 Полученообщейкислоты Продолжи- тельность Времяначала,Получено лимонной Способ веденияпроцесса долив аводы,сут кислоты за цикл,кг3200 2748 Прототип Предлагаемыйпо примеру 3412 3014 5,4 Со 2 2858 3320 С 3 10 2400 3000 5,0 С 4 Выхбдлимонной Способ веденияпроцесса на 1 т лимонной кислоты кислоты на цикл от сахара, 7 7716 Прототип 10,0 77,4 2808 Предлагаемыйпо примеру 2952 11,2 3,6 8897 69,8 10,9 8897 3113 10 9,6 58,6 8897 3707 ВНИИПИ Заказ 1553/34 Тираж 490 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Съем лимонной кислоты с 1 м в сутки,кг 1221241 14Таблица 2 процесса,включая;0,5 сутподготовительноПродолжение табл,2Расход 467-ной по сахару мелассы, кг