Способ определения таксономической принадлежности кальмаров

(19) (1 1): СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧ ГОЖИХРЕСПУБЛИН А(51) А 01 Й ОБР ТЕЛЬСТВУ АВТОРСКОМ цова,(56логиСиб196 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Тихоокеанский научно-исследова.тельский институт рыбного хозяйстваи океанографии) 1. Рычков Ю.Г, Особенности сероческой дифференциации народовири. - "Вопросы антропологии",5, У 21, с, 18-.44,2. Медников Б.М. Геносистематикаи типология. - "Зоологический журналвып. 9, т. ТЧ, 1974, с. 1301-1310.3. Авторское свидетельство СССРВ 1001898, кь А 01 К 61/00, 1980. ДНИЯ. "Ъ,(54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАКСОНОМИЧЕСКРЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КАЛЬМАРОВ по морфологии и каталитическим свойствам конститутивных ферментов гомогенатов тканей кальмаров, определяемым по кинетическим параметрам скорости гидролиза субстрата ферментами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения, после определения скорости гидролиза п 11 и одной концентрации субстрата в реакционную средувводят ингибитор, инкубируют и опре-, деляют остаточную активность конститутивных ферментов при той же концен В трации субстрата, причем для определения таксономической принадлежности кальмара используют бимолекулярную константу ингибирования. С:2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве конститутивных ферментов используют фосфотазу и холинэстеразу.Изобретение относится к зоологии и морскому промыслу, а точнее к рациональному рыболовству и воспроизводству вида, в частности к уточнению систематики.малюсков с помощью биохимии.Известны биохимические методы уточнения таксономии, например серо- логический метод Г 11, основанный на связывании антигенных белков с анти телами, и геносистематичесиий Г 2 3, основанный на изучении свойств отдельных генопродуктов - последовательности аминокислотных остатков в белках и нуклеотидах в РНК. 15Недостатками указанных способов являются длительность и сложность ,определения таксона.Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности энзимологический метод 3 3, использующий для уточнения систематики субстратную специфичность ферментов. Согласно этому в качестве сравниваемого биохимического признака изучается суб- стратная специфичность ферментов класса гидролаз, действующих на сложные эфирные связи (Кф 3,1), и сопоставляются кинетические параметры энзиматического гидролиза. Кроме того, предусмотрено использование возможности взаимодействия высокоспецифических субстратов с фосфатазой (КВ 3.1.3.2) и холиэнэстеразой (КВ 3. 1. 1.7), т,е, с такими ферментами, каталитические свойства35 которых не изменяются в процессе развития особи (так называемые конститутивные ферменты). 40Недостатками известного метода являются относительная сложность и некоторая длительность .так как для построения кривых гидролиза субстратной специфичности необходимо измерять активность (скорость) не при одной высокой, а при малых, средних и больших величинах концентраций (5-10 тод;ек) субстрата, что в свою очередь, требует большого расхода реактивов. Кроме того, большое количество измерений и вычислений несколько снижает точность и воспроизводимость метода.Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа;Поставленная цель достигается тем, что после определения скорости гидролиза при одной концентрации субстрата в реакционную среду вводят ингибитор, инкубируют и определяют остаточную активность конструктивных ферментов при той же концентрации субстрата, причем для определения таксономической принадлежности кальмара используют бимолекулярную константу скорости ингибирования.Предлагаемый метод уточнения таксономии предусматривает взаимодействие высокоспецифичных ингибиторов с фосфатазой (КФ 3.1.3.2) и холинэстеразой (Кф 3.1.1.7).Высокая сп цифичность предопределяет прежде всего самый минимальный расход ингибиторов, так как их ингибирующая деятельность на активность ферментор проявляется при очень низких концентрациях (10 моль и ниже). Более того, для уточнения таксономической близости особей необходимо произвести только два измерения: измерение начальной активности Ч (без ингибитора); измерение остаточной активности фермента после ингибирования Ч. Высокая чувствительность ингибитора, т.е. действие его в очень низких концентрациях, является основой высокой воспроизво. димости метода. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.Готовят гомогенат соответствующей ткани для исследования: гомогенат оптических ганглиев кальмаров для определения свойств холинэстераз и фосфатаз или их гонад для изучения свойств фосфатаз. Готовят растворы соответствующих субстратов для каждого из ферментов: холиновые эфиры уксусной, пропионовой, масляной и т.д. кислот для холинэстераз;. фосфорные эфиры ортофосфорной кислоты для фосфатаз. Определяют начальную скорость гидролиза 7 этих субстратов под действием ферментов и скорость гидролиза Ч этих субстратов после взаимодействия фермента с ингибитором в течение 2 мин. Рассчитывают бимолекулярную константу взаимодействия фермента с ингибитором К;,. Путем сравнения полученных данных, определяющих биохимический признак особи, уточняется таксономический ранг особи.Гомогенаты тканей имеют различную концентрацию - от самой большой 100 мг/мл при низкой активности в79 11420 30 3ткани до самой низкой 10 мг/мл при высокой активности. Наиболее важным для данной стадии является приготовление при помощи гомогенизатора тонкодисперсной равномерной взвеси.Раствор соответствующих субстратов готовят в любой концентрации (в пределах от 1 10- до 110- М), например 1-10- М, приэтой концентрации измеряют как Ч , так и Ч. 10Метод определения холинэстеразной активности (скорости гидролиза Чо) основан на потенциометрическом титровании щелочью кислот, образующихся в ходе ферментативного гидролиза суб стратов: уксусной - из ацетилхолина, пропионовой иэ пропионилхолина, масляной из бутирилхолина и т.д.Метод определения фосфатазной активности основан на измерении образу ющихся при ферментативном гидролизе эфиров ортофосфорной кислоты фосфатов, которые при взаимодействии с молибдатом аммония образуют соли гетерополикислот, восстанавливающихся амидолом до молибденовой сини.На основе полученных данных К;, рассчитывают по формуле: 2 Ло 2,Ъопытное Ч ф 13 1 С 12 ф Ч ВЗ "контрольБимолекулярная константа К;, является характерным биохимическим при знаком особи.Предлагаемый метод позволяет определять более низкий токсономический ранг, вплоть до подвида, кроме того, упрощается способ определенияи сокращается время получения ре- о 1 зультатов анализа в связи с тем, что, во-первых, измерение проводится только при одной высокой концентрации субстрата, во-вторых, для вычисле ния величины К 1, не требуется вычисления величины Ч, поскольку в овязи с тем,.что она входит как в числитель, так и в знаменатель формулы, можно подставить значения скорости 50 реакции, измеренные в секундах, какдля контроля (контроь), так и дляопыта после ингибирования ("опь 1 тное 1Для способа также характерны высокая воспроизводимость результатов, так 5 как значительно сокращены длительности подготовки эксперимента, приготовление лишь одной выбранной концентрации раствора субстрата, определенной концентрации ингибиторов, соли, гомогената фермента. Обработка результатов состоит лишь в определении К-. Метод обеспечивает повышенние точности определения, так как свойства изучают при одновременной реакции высокоспецифичных субстратов и высокоизбирательных ингибиторов,П р и м е р 1. Уточнение таксономии с помощью фосфатазы ганглиев.Активность фосфатазы определяли по модифицированному методу Боданского, согласно которому образующиеся при гидролизе эфиров ортофосфорной кислоты фосфаты при взаимодействии с молибдатом аммония образуют соли гетерополикислот, восстанавливающиеся амидолом до молибденовой сини, обладающей ярко-синей окраской с максимумом поглощения в зоне 750 нм. Оптическую плотность молибденовой сини определяли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК, светофильтр Ф 7 или с помощьюспектрофотометра СФпри. длине волны 750 нм. Калибровочную кривую строили, используя в качестве источника фосфата водный раствор КН РО . Исходный раствор содержал в 1 мл 50 мкг Р. Количество фосфата в пробе изменяли от 2,5 до 4,5 мкг. За единицу активности принято такое количество фермента, которое образует при гидролизе соответствующего субстрата за 1 ч при 30Ь 1 мкмоль Р.Ткань гомогенизировали в 9 объемах 0,1 М хлористого калия; конечная концентрация ткани с= 100 мг/мл. Активность определяли при рН 3,5, которое поддерживали буфером 0,2 М глицин - 0,2 МНС, содержащимсдля стабилизации фермента 110- М раствор хлористого магния. В качестве субстрата использовали алифатический эфир ортофосфорной кислоты о-глицерофосфат.Исходный раствор субстрата - с- глицерофосфата (3 -10 " М) готовили на воде (с последующим доведением рН раствора до, соответствующего для опыта значения 0,2 М раствором НС 1).Для каждого опыта готовили 3 пробы; первая (первый контроль) служит контролем на самопроиэводный (спонтанный) гидролиз используемого субстрата - к 0,5 мл буфера добавляли0,5 мл воды; вторая (вторичный конт 1142079роль) является контролем на содержание фосфора в исходной ткани - к0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл Н Ои 0,5 мл гомогената, третья (рабочая) - к 0,5 мл буфера добавляли 50,5 мл гомогената, Активность измеряли при концентрации субстрата 3 10 М,Начальную скорость гидролиэа Чрассчитывали по формуле; 4 содержание Р мк моль Ро 20,5 31ч мл 4 - число,. которое показывает какуючасть от общей смеси брали на фотометрирование после центрифугировании 4 (0,5 мл из 2 млсмеси); где содержание Р------ - количество фосфора31 фнеорганического,мк моль, образующе-гося в процессеФерментативной реакции (рабочая проба) за вычетом суммы количества Р 55первого и второгоконтроля;2 - время инкубации,ч;Пробы инкубировали 15 мин при 30 в термостате, а затем через равные промежутки времени (1 мин) в первый контроль и рабочую пробу добавляли 0,5 мл субстрата, предварительно нагретого до 30 , и инкубировали далее все три пробы в течение 2 ч,после 15 чего реакцию останавливали введением в каждую пробу последовательно по 0,5 мл 307-ной трихлоруксусной кислоты через те же промежутки времени (1 мин). Смесь центрифугировали на 20 настольной центрифуге ЦУМпри комнатной температуре в течение 15 мин при и = 5000 об/мин, после чего к 0,5 мл надосадочной жидкости добавляли 3,5 мл воды и О,б мл 2,57-ного 25 раствора молибдата аммония в 6 н. Н ЯО и 0,4 мл 0,57.-ного раствора амидола в 57-ном растворе Иа БО. Амидол,добавляли в каждую пробу через равные промежутки времени(1 мин) 30 с тем, чтобы через это же время после инкубации в течение 20 мин измерять оптическую плотность.(При работе с ингибитором - диизопропилфторфосфатом (ДФФ) при концентрации 8 10 М в первую пробу к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл воды и 0,2 мл ингибитора; во вторую пробу к 0,5 мл буфера 0,3 мл воды;0,5 мл гомогената и 0,2 мл ингибитора; в третью к 0,5 мл буфера 0,5 мл гомогената и 0,2 мл ингибитора.После инкубации в течение 15 мин через равные промежутки времени в первую пробу (первый контроль) .и в третью пробу (рабочую) добавляли 0,3 мл субстрата. Дальнейшая методика работы осталась прежней.Скорость гидролиза Ч. рассчитывали аналогично Ч , причем содержание Р - это количество неорганического фосфора (мк,моль), образовавшегося в процессе ферментативной реакции после взаимодействия ингибитора с ферментом.Бимолекулярулт константу К; рассчитывали по формуле: Таблица 1 Вид кальмара К 6 Командорский ВеггуСецйЬхз шад.зсегНовозеландский Иойосодагиз з 1 оап з 1 3,410 0,7 10 Э П р и м е ч а н и е. Субстрат -ь-глицерофосфат, ингибитор ДФФ. 23 ЧоК- = 1 д6 с 1 Чгде 2,3 - коэффициент перехода отнатурального логарифма кдесятичному;С - время инкубации (взаимодествие ингибитора сФерментом, мин);13 - концентрация ингибитора,при которой наступает507-ное торможение, М;Ч - начальная скорость гидроолиза;Ч - скорость гидролиза послевзаимодействия ингибиторас ферментом.Бимолекулярная константа скорости К ингибирования активности фосифатазы ганглиев командорского и ново. зеландского кальмаров приведана в табл.1.П р и м е р 2. Уточнение таксономии с помощью фосфатазы гонад.Субстратную специфично г фосфатазы гонад определяли аналогично примеру 1.Бимолекулярная константа скорости К;, ингибирования активности фосфатазы гонад командорского и новозеландского кальмаров приведена в табл. 2. 1 О Таблица 2 Вид кальмара Кп 15 Командорский ВеггусепсЬяшад 1 ясе 3,1; 10 Новозеландский Иососойагця я 1 оапх я 1 1,4, 10" 20 П р и м е ч а н и е. Субстрат -фенилфосфат, ингибитор Дфф. П р и м е р 3. Уточнение токсономии кальмаров кинетико-энзимологическим методом путем изучения ингибиторной специфичности холинэстеразы оптических ганглиев Опппоясгерйез Ьагсгапп семейства ОшшаясгерЬЫае. ЗХолинэстеразную активность определяли методом потенциометрического титрования (Яковлев, 1965) при рН 7,7 щелочью кислот, образующихся при ферментативном гидролизе следующих холиновых эфиров (субстратов); иоди 35ды ацетилхолина (АХ 7 -СНЗС(0) ОСН СН 6(СН ) убутирилхолина (БуХ)- -ССН 2 СН 2 С(0)ОСН 2 СН 2 И(СН)з, бромид ацетил-ь-метилхолина (МеХ) --СН,С(0)ОСН(СН )СН (СН ) еАктивность фермента при отсутствии ингибитора определяли в единицах начальной скорости Ч , для чего в стеклянную (с = 25 ), подключенную к термостату термостатируемую кювету, вносили последовательно 1 мл 7. 10 фМ фосфатного буферного раствора с рН 7,7.; 0,2 мл гомогената ткани оптичесО кого ганглия; 1 мл 1 М раствора хло-. ристого калия; определенное количество дистиллированной воды до общего объема пробы 10 мл с учетом добавляемого в последнюю очередь объема субстрата. Смесь перемешивали магнитной мешалкой, проверяли рН реакционной смеси (не ниже 7,7), после чего вносили субстрат, количество которого рассчитывали таким образом, чтобы его конечная концентрация была равна принятой для опыта. Образующуюся в ходе ферментативного гидролиза карбоновую кислоту определяли титрованным раствором щелочи, которую добавляли из откалиброванной (1 см 4- 6 мкм) бюретки небольшими порциями с таким расчетом, чтобы отклонения стрелки на шкале не превышали 7,.5+ 0,1 рН. Контроль рН осуществляли при помощи стеклянного и хлорсеребря.ного электродов и проточного электрода сравнения, подключенных к высоко- чувствительному потенциометру типа рН 262, рН 673, рН 340.Величину активности фермента в единицах начальной скорости реакции рассчитывали по формулеиз ЧизЧ = -- Эгде И - нормальность раствора щелочи, мкмоль/мл;Ч- количество раствора щелочи,затраченной на титрование,с - продолжительность титрова- .ния, мин.Активность фермента в присутствии ингибитора определяли в единицах скорости реакции (Ч ), для чего в стеклянную термостатйруемую кювету вносили последовательно 1 мл 7 10 фМ фосфатный буферный раствор с .рН 7,7;0,2 мл гомогената ткани оптического ганглия; 1 мл 1 М раствора хлористого калия; определенное количество дистиллированной воды до общего объема пробы 10 мл с учетом добавляемого в,последнюю очередь объема субстрата; смесь перемешивали магнитной мешалкой, проверяли рН реакционной смеси (не ниже 7,6),.затем вносили фосфорорганический ингибитор, объем раствора которого подбирали экспериментально таким образом, чтобы его конечная концентрация в робе без субстрата вызывала точно 507-ное снижение Ч за строго определенное и измеряемое секундомером время инкубации (например, 2 мин) фермента с ФОИ. Субстрат вносили в тот момент, когда время инкубации было равно заданному для опыта. Количество субстрата, должно быть равным количеству субстрата в контрольном опыте (по оп1142079 12кальма- они приведены в единой граюга Ти- фе под названием "Юзщые фор" в табл.З мы". Так как величины Кров Ига Атлантики и БАЗ хого океана тождественны,ТаблицаЗ Бимолекулярные константы (К-) М "мнн " скорости взаимодействия фосфор 6органических ингибиторов с холинэстеразой оптических ганглиев кальмаров Бартрама из различных частей ареала Южные формы Северо-западнаячасть Тихого СевернаяАтлантика ФОИ Субстрат океана 7,5 10 3,5 10 1,110 Дфф ЛГ Гд ГА ГА4,1 10 БуХ ЛГГдГАГАМеХ ЛГГдГА ГА4,9 10 Как показывают критерии различия (табл. 4) другие ингибиторы, например ЛГи ГА, также дают различные величины К для холинэстераз кальмаров разных форм (для Южной и Северной Атлантики с ГАпо бутирилхолину и с ЛГпо ацетилхолину; для 1 цжных форм и северо-западной части Тихого океана с ЛГпо бутирилхо 1 лину; для северо-западной части Ти-. хого океана и Северной Атлантики с ЛГи ГАпо бутирилхолину)4,3 103,9 104,4 104,2 103,1 104,2104,3.10 ф5,2 10 ф1 ф 14,8 10 ь Сравнение величины К- для кальманров четырех частей ареала, определен,ной по пяти ингибиторам и трем субстратам, показало, что уже один ингиби-о тор Дфф дает очень большие различия. Так например, по АХ К;, для южных форм намного выше (в 2,3 раза) К;, для Севера Атлантики и еще вьппе (в 10 раз) К;, северо-западной части Тихого океа 55 на. Таким образом, налицо явное биохимическое различие всех .трех форм кальмаров,7, 1044,6 101,4 103,3 104,6 1042,1108,3104,7 .101,3 103,3 102,7 106,2104,4 10Ф5,5.10 1,8 107 1 О 4 1;5 10 3,310 4,5 104 1,7 101 5,3 10 4, 5,10 1,4 10 4,6 10 6,6 10 ф 5,4 101 1,7.108 5,4 10 4,7 10414 1142079 13 Таблица 4Критерии различия при сравнении холинэстеразы ткани оптическихганглиев кальмаров трех различных районов ареала Район БуХ МеХ 3,2 Южные формы и Северная Атлантика 3,3 2,9 2,9ЛГ1,8 Гд 1,2 1,0 ГА ГА0,9 3,3 0,9 1,2 0,9 Южные формы и северозападная часть Тихого океана 6,4 1,0 3,3 ЛГ2,9 Гд1,3 0,9 1,0 ГА ГА1,0 1,0 1,3 Северо-западная частьТихого океана и Северная Атлантика 4,9 3,0 2,9 1,2 ЛГ3,0 1,0 Гд10 1,0 ГА ГА1,0 3,3 1,3 1,0 Таким образом, кинетико-энзимологический метод исследования ингибиторных свойств холинзстеразы кальма- .ров, Бартрама из четырех частей ареала (севера Атлантики, северо-западной части Тихого, БАЗ юга Тихогои юга Атлантического океанов) пока-.-.45зал, что совокупности особей, населяющих разные четыре части ареалапредставляют собой три подвида, т.е.три географические формы, обладающиегенетически закрепленными морфо-физио 0логическими особенностями, в томчисле и стабильными различиями структурных характеристик функциональных медиаторных систем.С помощью предлагаемого способауточнено как систематическое положение командорского ВеггуйецсЬхзшазгег и новозеландского Иойойодагцз з 1 оап з 1. кальмаров Ошшазггер".Вез Ъагггашд из четырех частей ареала (Севера Атлантического, северозападной части Тихого, БАЗ юга Тихого и юга Атлантического океанов).Сравнение бимолекулярных констант К.11 определенно показало, что совокуп ность особей О.Ъагггаш 1, населяющих эти разные четыре части ареала, представляют собой три подвида, следова- тельно, они не могут быть взаимозаменяемы при промышленном рыболовстве. Этот Факт следует учитывать для рационального ведения промысла.Таким образом, результаты работ имеют практическое значение для правильного рационального воспроизводства вида.Научное значение метода состоит в том, что он дает возможность правильно построить и уточнить систематику головоногих моллюсков.