Способ получения растворов сахаров

1254 А СПУБ ш 4 С 13 К 1 ГОСУД АРС ПО ДЕЛА ЕНИЯЗОБР Знам ННЫЙ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ ИОтНРЦтйй(71) Ордена Трудового Красногони институт химии древесины(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРОВСАХАРОВ, предусматривающий ферментативный гидролиз полисахаридного сырьяв буферной среде, состоящей из уксусной кислоты и соли слабой кислоты вконцентрации 0,05-0,1 И, с введениемконсерванта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процессаи повышения качества целевого продукта, в качестве соли слабой кислотыи одновременно консерванта используютбенэоат натрия.12540Изобретение относится к биохимическому получению пищевых и кормовыхсахаров из растительного сырья и преимущественно может быть использованов гидролизной и микробиологическойпромышленности,Цель изобретения - упрощение про"цесса и повышение качества целевогопродукта.Способ осуществляют следующим об Оразом.Качество буфера определяют буферной емкостью р, которая характеризует способность раствора сохранятьпостоянное значение рН при добавлении 15к нему кислоты или основания, 0,050,1 И раствор, состоящий из смесибензоата натрия и уксусной кислоты,имеет высокое значение р (максимальное значение р по отношению к НС 1 2 ппри рН 4.,8 составляет 0,051, а по отношению к МаОН при рН буфера 4,2 значениеравно 0,047), что приравнива"ют предлагаемый буфер к широко употребляемому буферу, состоящему из ацетата натрия и уксусной кислоты. Крометого, 0,1 М и тем более 0,05 М раствор буфера состоящий из бенэоатанатрия и уксусной кислоты, при значении рН чне снижает активности геми-ЗОцеллюлаэных и целлюлаэных Ферментов,имеющих оптимальные эначенин рН-действия в этом интервале, Это огределяоет возможность использования предлагаемого буфера для поддержания значения при рН при Ферментативном гидролизе полисахаридов, Бензоат натрияявляется консервантом, что предохраняет реакционную среду, в которойпроходит ферментативный гидролиз растительного сырья, от микробного заражения. Для получения буферного раствора берут от 0,05 до 0,1 М раствор уксусной кислоты и бенэоата натрия, так как.при употреблении буфера ниже этой концентрации он не проявляет стабильное консервирующее действие, а вышее - нестабилен ввиду выпадения бензойной кислоты при низких значениях рН, 5 ОДля определения объемньгх соотношений растворов выбранной молярности компонентов буфера и получения требуемого значения рН, которое определяется применяемым для гидролиэа ком плексом Фермента, компоненты взаимно титруют до получения требуемого рН буферного раствора, Таким образом,12 3можно составить таблицу для определе"ния взаимных соотношений молярныхрастворов бенэоата натрия и уксуснойкислоты, обеспечивающих любые искомыезначения рН (см, табл. 1). Дальнейшим этапом подготовки реакционной среды к ферментативному гидропиэу является включение в буферный раствор фермента и субстрата, количество которыхопределяютконкретным случаем, Ферментативный гидролиз проводят в ферментерах в статических условиях, в реакторах, снабженных диалиэирующей мембраной для отвода ниэкомолекулярных продуктов реакции,или в ферментерах колоночного типа с неограниченной продолжительностью без опасности заражения реакционной среды или отобранных растворов сахаров микроорганизмами.П р и м е р 1. 1,0 г соломы с размерами частиц меньше 2 мм и влажностью бХ, обрабатанной 1,07-ным раствором ИаОН, помещают в колбу на 200 Мл с резиновой пробкой. Для осахаривания этого субстрата используют ферментный комплекс целлокандин, имеющий оптимальное действие при значении рН 5,0,Сначала приготавливают буферный раствор, состоящий из 43,5 мл О, 1 М раствора бенэоата натрия и 6,5 мл О, 1 М уксусной кислоты. Для перевода 0,1 М раствора в 0,05 М к приготовленному раствору прибавляют равное количество (50 мл) дистиллированной воды, имеющей значение рН 6,5; 1,0 г фермента растворяют в приготовленном буфере путем медленного перемешивания в течение 10 мин магнитной мешалкой, потом нерастворимую часть фермента отделяют на стеклянном фильтре. Приготовленный ферментный раствор, имеющий значение рН 5,0, наливают на субстрат, колбу закрывают и помещают в термостат при 10 С, В начале и в конце опыта измеренное значение рН реакггионной соепы равно 5,0+0,2. Через 3, 6, 2 ч и 168 ч колбу вручную встряхивают и отбирают пробы в количествемл, которые немедленно прибавляют к 2 мл дисктилпированной воды, нагретой до 98 С, и вьцгерживают 10 мин на водяной бане для инактивации фермента, В такой пробе, учитывая трехкратное ее разбавление, определяют количество редуцирующих веществ методом Шомодьи и подсчитывают их количество на абсолютно сухой исходный субстрат,Полученные растворы сахаров в присутствии бензоата натрия не содержат токсичное соединение - толуол, что поньппает их качество, и поэтому могут быть использованы для кормовых и пищевых целей без особой очистки, так как бензоат натрия допущен, как консервант, в пищевой и кормовой промьнпленности..1 125 Таким образом параллельно станят три опыта. Количество РВ после 3 ч составляет в параллельных опытах 14,2, 18,6 и 21,47, после 6 ч - 35,9, 33,6 и 37,3 ; после 24 ч - 52,9,. 46,8 и 52,47; 168 ч - 68,9, 71,6 и 70,37. соответственно (см, табл. 2,среднее значение опыта 4).П р и м е р 2, Осуществляется аналогично примеру 1, концентрация О используемого бензоатного буфера составляет О, 1 М. Выход РВ через 3, 6, 24 и 168 ч гидролиза составил соответственно 13,6, 34,9, 52,5 и 70,67. (приведено среднее значение, 15 см табл. 2, опыт 3).П р и м е р 3. Субстратом является ксилан, выделенный из овса, а ферментом - ксилавомарин ГОХ,имеющий оптимум действия при рН среды, 10 равном 4. Приготавливают 100 мл О, М буферного раствора, имеющего рН 4,0, смешиванием 79,2 мл О, 1 М раствора уксусной кислоты и 20,8 мл 0,1 И раствора бензоата натрия, до бавляют 0,1 г фермента и О, г субстрата, перемешивая все компоненты 10 мин магнитной мешалкой, Приготовленная реакционная среда имеет рН 4,0, Аналогичным образом, как в при- З 0 мере 1, закрытая колба помещается в термостат при 40 С. Через 3, 6, 24 и 168 ч отбирают пробы для анализа и измеряют рН среды, Значения рН в трех параллельных опытах во время непрерывного гидролиза составляет 4,0+0,2, Количество РВ после 3 ч составляет в трех, параллельных опытах 21,1, 29,7 и 28,1%; через 6 ч - 46,8, 49,6 и 55,2 Х; 24 ч - 56,9, 62,4 и 63,97;168 ч - 73,6, 67,6 и 74,2% соответственно (см. табл, 2, среднее значениеопыта 7).П р и и е р 4, Осуществляется аналогично примеру 3, концентрация используемого ацетатного буфера составляет 0,05 М. Выход РВ (средние значения) через 3, 6, 24 и 168 ч составляют соответственно 27,5; 50,7;64,9 и 72,17. (см, табл, 2, опыт 8),П р и м е р ы 5-6, Проводят Ферментативный гидролиэ в 0,05 И ацетатном буфере, приготовленном известным способом,со значением рН 5. Субстрат и фермент, а также их концентрация - ,4012 4такие же, как в примере 1, Опыт проводится по примеру 1, но как консервант применяется толуол. Расход толуола на 100 мл реакционной среды -5 мм.Вьжод РВ в трех параллельныхопытах после 3 ч составляет 15,3,19,1 и 16,07; 6 ч - 33,2, 36,6 и 32,97.24 ч - 59,4, 51,3 и 46,8%; 68 ч -64,8, 67,4 и 60,17 (см, табл. 2,средние значения опыта 2),Аналогичный эксперимент осуществляют в О, М ацетатном буфере. ВыходРВ (средние значения) через 3, 6, 24и 168 ч составил соответственно 13,0,33,9, 49,5 и 60,57 (см, табл, 2,опыт 1).П р и м е р ы 7-8. Осуществляются аналогично примеру 3. Согласнопрототипу гидролиз проводят в 0,1 Мацетатном буфере (рН 4) с добавлениемтолуола (5 мл/100 мл реакционнойсмеси). Выход РВ (средние значения)через 3, 6, 24 и 168 ч составилсоответственно 25,9, 53,9, 64,5 и66,37 (см. табл, 2, опыт 5).Аналогичный эксперимент осуществляют в 0,05 М ацетатном буфере. ВыходРВ (средние значения) через 3, 6, 24и 168 ч составил соответственно 26,9,55,9, 62,2 и 69,3 Ж (см. табл, 2,опыт 6),Таким образом, для составления реакционной среды создания требуемогозначения рН среды и ее консервирования по предлагаемому способу требуются только компоненты буфера, чтообеспечивает упрощение процесса гидролиза,Присутствие бензоата натрия н среде Ферментативного гидролиза полисахаридсодержащих субстратов не снижаетактивности Ферментов, а в некоторыхслучаях даже способствует повьппениювыхода РВ по сравнению со средами,содержащими ацетатный буфер и толуол.254012 Таблица 1 рН (20 С) 0,1 М бензоат натриямл О, И уксуснаякислота мл По НС 1 25,0 0,06 1,0 3,4 63,0 0,22 3,6 5,0 32,0 20,0 76,0 0,30 4,0 20,0 20,0 38,0 4 ф 2 0,50 0,027 0,038 22,0 4,4 0,66 20,0 11,0 0,93 20,0 6,0 20,0 3,0 1,25 5,0 5,2 20,0 5,4 20,0 20,0 1,37 0,7 Таблица 2 Выход РВ, 7, на субстрат при продолжительности ферментолиза, ч рН буФерного раствора Опыт БуФер . 6 24 168 Субстрат - солома, фермент - целлокандин 0,01 13,0 33,9 49,5 60,5 64,2 0,05 16,8 34,2 52,5 О,34,9 13,6 18,1 70,6 Оф 05 35,6 50,7 70,3 Субстратксилан, фермент - ксилавомарин 0,1 64,5 53,9 66,3 55,9 62,2 69,3 0,10,05 26,3 27,5 50,5 50,7 71,8 64,9 72,1 е зьСоставитель А, Синицын Техред М.ХодаиичКорректор М. Самборская Редактор Л. ПовханЗаказ 468729 Тираж 328 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно"полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1 Ацетатный 2 Ацетатный 3 Бензоатный 4 Бензоатный 5 Ацетатный 6 Ацетатный 7 Бензоатный 8 Бензоатный Концентрация буферного раствора, Ит Содержа"иебензоата вбуфернойсмеси, 7. 0,013 0,013 0,015 0,019 0,046 0,051 0,048 0,040 0,029 0,021