Способ усиления роста нежвачных животных

Союз Соеетскик Социалистических Республик/2388104/30-15 (23) Приоритет - (32) 17. 01. 75 А 23 К 1/17 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(53) Удк 615.779.9; :641.18(088.8) ИностранцыВальтер Даниель Селмер, Вальтер Патрик Каллен,Джон Бродерик Раутин (США), Чарльз Эдвард Моппетт(72) Авторы изобретения Иностранная фирма "Пфайзер Инк" (США)(54) СПОСОБ УСИЛЕНИЯ РОСТА НЕЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХИзобретение относится к способу усиления роста нежвачных животных, например, свиней.Известны способы усиления роста животных путем введения в корм препаратов антибиотиков (1 .Недостатком известных способов является их незначительная эффективность.Цель изобретения-повышение эффективности способа усиления роста нежвачных животных путем улучшения использования ими корма.Это достигается тем, что в качестве препарата антибиотика исполь зуют смесь основного макроцикличес" кого лактона и депсипептида в соотношении 1:2-1, продуцируемую штаммом Лсй(порсапев ангвиссо сог АТСС 31011.Новые синергетические смеси анти биотиков, охватываемые изобретением, дополняют семейство других описывавщихся синергетических смесей микамйцина, пристинамицина, остреогрицина, стрептограмина, Р,А. 114, вернамицинзв 6.5 и виргиниамицина.Изобретение охватывает применение смеси антибиотиков, получаемой при проведенном в погруженном состоянии аэробном росте Асспор 7 апев ацгац О тсо 1 ог АТСС 31011 в водной питательной среде. Эта смесь, содержащаямакроциклические лактоны и депсипептиды, может быть выделена и рекуперирована иэ ферментационного бульонапутем экстракции растворителем, противоточного распределения,.колоночнойхроматографии или комбинацией этихспособов. Индивидуальные компонентыантибиотиков обладают существеннойбактерицидной активностью. Сыраясмесь антибиотиков или комбинациячистого макроциклического лактонаи чистого депсипептида, полученныхиз сырой смеси, показывает значительную синергетическую бактерициднуюактивность. Сырая смесь антибиотиков,чистые индивидуальные компоненты исмеси чистых макроциклических лактонов и депсипептидов являются эффективными агентами увеличения ростацыплят и свиней и терапевтическимиагентами при лечении дизентерии усвиней. МикроорганиЗи, пригодный для получения антибиотиков, изобретением, был выделен из образца почвы из Египта. Для выращивания пользовались картофельно-"морковным агар-агароми было установлено, что он принадлежит к классу антиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию вида Асйпор 1 апез. Поэтому для роста пользовались различными средствами, применявшимися при выращивании этйх видов. Суспензии культуры готовили путем дробления кусков культуры, снятой с пластинок с агар-агаром. Эти суспензии употребляли для выращивания культуры в пробирках, на пластинках или в чашках Петри, на различных средах. Температура инкубации составляла 28 С. Результаты опытов фиксиро. вали через интервалы вплоть до 22 дней при некоторых опытах, но большинство результатов регистрировали через 14 дней. Окраска культуры оценивалась по Иэрцу и Паулю (Словарь окрасок", 2-ое издание, 1950.). Эта новая культура (Пфизер Г. 24090) была доставлена в Американскую Коллекцию Типов 20 Культур в Роквилле, Мэриленд, 11 марта 1974 и получила название Аспор 3 апеь ацгаойсо 2 ог АТСС 31011.Среды для итендификации применявшиеся для охарактеризования культуры 2 и ссылки на их состав, приведены ниже:2-ный агар-агар на водопроводной. водеКартофельно-морковный агар-агар (следует испольэовать только 30 г картофеля и 2,5 г моркови на 20 г агар-агара)Сахарный агар-агар ЧапекаГлюкозно-аспарагиновый агар-агарАгар-агар с экстрактом дрожжей и солодомАгар-агар Хики и ТреснераКартофельно-глюкоэный агар-агарКрахмальный агар-агарЖелатина ОТирозиновый агар-агарЖелезо-пептоновый агар-агар ДифкоСнятое молоко ДифкоДекстрозно-нитратный бульонСреды 9 1 с 3,0 г глюкозы вместо сахароэы и без агар-агараБульон на основе органического соединения и нитратаСреда АТСС 172Использование углеродаАгар-агар на водопроводной воде:. рост слабый, колонии тонкие, плоские, примерно 902 (очень слабо-розовые); воздушный мицеллий отсутствует,субстрат мицеллия от бесцветного до 902; растворимый пигмент отсутствует. Сахарозный агар-агар Чапека: рост от умеренного .до хорошего, колонии плоскиепримерно 966 (светло-оран-жевые);воздушный мицеллий отсутству О ет; субстрат мицеллия около 906;растворимый пигмент отсутствует.Глюкозно-аспарагиновый агар-агар: рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 99 (светлооранжевые); воздушный мицеллий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует. Агар-агар с экстрактом дрожжейи солодом: роста.не наблюдается.. Агар-агар Хики и Треснера: ростот умеренного до хорошего, колониислегка возвышаются и шероховаты,примерно 9 Г 9 (мутно-оранжевые);слабый беловатый налет на поверхности: субстрат мицеллия примерно918, бледно-коричневатый растворимый пигмент.Картофельно-глюкоэный агар-агар.рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 99 (светлооранжевые), воздушный мицеллий отсутствует: субстрат мнцеллия примерно99; растворимый пигмент отсутствует.Тирозиновый агар-агар: рост от слабого до умеренного, колонии плоские,примерно 13 А 10 (мутный красноватооранжевый цвет),воздушный мицеллийотсутствует, субстрат мицеллия примерно 10011; коричневый растворимый пигмент.Желатина: рост умеренный, колонииплоские, примерно 9 К 12 (красноватооранжевые), следы беловатого налета,субстрат мицеллия примерно 9 К 12; растворимый пигмент отсутствует.Крахмальный агар-агар: рост отумеренного до хорошего, колонии возвышающиеся, примерно 9 К 10 (оранжевые) слабый беловатый налет, субстрат мицеллия примерно 9 К 10; светложелтый растворимый пигмент,Крахмал подвергается слабому гидролизу; степень сжижения желатинывысокая, нитраты не восстанавливалисьдо нитритов, в любой среде, содержащей нитраты, даже за 22 дня (рост былочень слабым в декстрозно-нитратномбульоне, но хорошим в бульоне, содержащем органические вещества и нитрат); образование сероводорода - незначительное; в железо-пептоновомагар-агаре образования растворимогопигмента не .наблюдалось; в молокене наблюдалось коагуляции или гидролиза даже через 2 дня; тирозин не дигерировался; рост в среде АТСС 172наблюдался при 21-37 еС при наилучшемросте при 28-37 С; при температуре45 фС роста не наблюдалось. Арабиноэа,Фруктоза, глюкоза, маннит, раффиноэа,рамноэа, сахароза и ксилоза потреблялись; иноэит не потреблялся. Ни длякакой из сред. не наблюдалось запаха.Спорангий образовывался лишь на картофельно-морковном агар-агаре. Приэтом образовывался палисадный слой.Измерения указали на 5,5-11 х 4,5-8 мкмпо ширине и широте и 9-12 мкм . по высоте. Колонии были многочисленными,неправильными по форме и выбрасывалиспоры при постепенном размягчения.Спорангий на картофельно-морковномагар-агаре по прошествии трех недельиикубации выделял споры за несколькочасов при температуре около 21 ОС,если куски колоний погружали в небольшое количество раствора 1 г глюкозы и 1 мл "твина 80" в 1 л воды.Споры образовывали цепочки неправильной формы в спорангии, но, будучиосвобожденными от спорангия, становились субглобозными и имели ширинуот 1,6 мкм до эллиптической широкойформы 1,6-2,2 х 1,1 - 1,6 мкм. Почтивсе они были подвижными.Попытка идентификации привела ксравнению этой культуры с А, ацгац 1 со 7 ог АТСС 15330, Новые штаммы А.ац гац 1со аког АТСС 31011 и А. ац гав г 1 соРсг АТСС 15330 выглядели по существу сходными с морфологической точкизрения, окраски и растворимого пигмента на агар-агаре Беннета, питательном агар-агаре, агар-агаре с экстрактом дрожжей, глюкозно-аспарагиновомагар-агаре, глицерино-аспарагиновомагар-агаре, агар-агаре с яблочно-кис.лым кальцием и агар-агаре с тирозиномНи одна культура не восстанавливала нитратов до нитритов; обе ониобразовывали небольшое количество сероводорода и не образовывали меламинана железо-пептоновом агар-агаре, обеони вызывали гидролиз крахмала.А.ацгацг.со 2 ог АТСС 15330 не вызывализменений снятого молока в пробирках, в то время, как новая культуравызывала осветление трех из шестипробирок с молоком и по прошествии21 дня образовывался желто-кремовыйпигмент.А.ацгацсоГог АТСС 31011 потреблял глюкозу, арабинозу, фруктозу,маннит, раффинозу, рамнозу, сахарозу и ксилозу. А.ацгацсо 2 ог АТСС15330 потреблял все эти сахара, заисключением раффинозы. Спорангийи споры двух культур были сходнымипричем споры А,ацгаис 1 со 7 ог 15330были более сходными со стерженьками.А,ацгаиг.соРог АТСС 15330 непроявлял какой-либо бактерициднойактивности в условиях ферментации.А.ацгац 1 соГог АТСС 31011 образовывал смесь антибиотиков, охватываемую изобретением.Культивирование А.ацгацссо 1 огАТСС 31011 предпочтительно происходит в водной питательной средепри 28-36 С в погруженном, аэробном состоянии, при перемешивании,К числу питательных сред, полезныхдля этих целей, относятся те, вкоторые включаются источник усваиваемого углерода, такие как сахароза, крахмал, и мелассы; источникорганически связанного азота,такие, как казеин, продукт энзиматического дигерирования казеина,соевая мука, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса и глютен пшеницы. Источниками роста могут так 60 б 5 дованием различного типа, например, фильтр-прессы, центрифуги и т.д.Полезным способом является метод тонкослойной хроматографии на силикагеле; этот метод служит для анализа смеси антибиотиков, полученных в Фериентационной среде, и дает возможность установить состав сырых и очиже явиться отходы винокуренныхзаводов, рыбья мука и экстракт дрожей, а также соли такие, как хлористый натрий и карбонат кальция и следовые неорганические вещества, такие как железо, магний, цинк, кобальти марганец, которые также дают хорошие результаты. Если во время ферментации происходит чрезмерное пенообразованне, то можно вводить такие антипенообразователи, как растительныемасла или силиконы, добавляемые кпитательной среде. Аэрация среды врезервуарах при выращивании культур в погруженном состоянии, пред.15почтительно проводится со скоростьюоколо 1/2-2 объема свободного воздуха на объем бульона в минуту. Скорость перемешивания поддерживаетсяпри помощи мешалок, обычно сходных стеми, которые употребляют в бродиль 2 О ной промышленности. Само собой разумеется, что следует поддерживатьасептические условия ва время переносов организма и в течение всегоего роста.25 Агент инокулирования для приготовления смеси антибиотиков можетбыть получен путем использованиякультуры с пластинки культуры на среде, например, АТСС 172.ЭО В колбах при перемешивании ростобычно достигает своего максимумапо прошествии примерно 4 дней, в товремя как при инокулировании в резервуарах наиболее благоприятнымпериодом является период от 2 до3 дней. Значительная бактерициднаяактивность достигается на конечнойстадии ферментации примерно за20-30 час,40 Способ производства антибиотиков во время процесса ферментацииобычно контролируется биологическимипроверками бульона в применениичувствительного штамма 5 сарпу 1 ососсцвацгець. При этом применяется стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона ингибирования,окружающая кружок фильтровальнойбумаги, насыщенной бульоном, принимается за меру бактерицидной активности. После того, как бактерициднаяактивность сбраживаемого бульонадостигла желаемого уровня, продукты выделяют либо из всего бульона,либо из профильтрованного бульона.В последнем случае мицелий удаляютпутем отфильтровывания или центрифугирования. Можно пользоваться оборущенных материалов, выделенных экстракцией из сбраживавшихся бульОнов, Разделение компонентов смеси антибиотиков, само собой разумеется, зависит от содержания антибиотиков в системе. Слишком малая бактерицидная активность 5 не дает возможности обнаружить те компоненты антибиотика, которые присутствуют в малых количествах; слишком высокая бактерицидная активность приводит к эффекту сопротивления с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением.Система проявителей при тонкослойной хроматографии представляет собой смесь хлороформа с этанолом1 Эй И (9:1). Тонкослойные хроматограммы после проявления могут осматриваться в ультрафиолетовом свсте при длине волны 254 и 366 ммк.Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов может быть осуществлено путем наложения тонкослойной хроматограммы на агар-агар с питательными веществами, в который внесены зародыши чувствительного штамма Яарпу 2 ососсцз апгепз или другого чувствительного организма.К числу главных компонентов смеси антибиотиков, выделяемой А.ацгао- соГог АТСС 31011, относится ряд макро- циклических лактонов и депсипептидных бактерицидных компонентов, Появление или непоявление или процентный состав смеси этих антибиотиков меняется от ферментации к ферментации и является Функцией времени, величины рН состаДГ ва среды и т.д. При наборе условий приведенных в примерах, главными бактерицидными компонентами смеси анти,биотиков являются Соединения 37277, (депсипептид) и 39926(макроцикли ческий лактон), в то время, как к числу бактерицидных компонентов, присутствующих в незначительном количест ве, относятся Соединения 37932 (депсипептид) и 35763 (макроциклический 45 лактон).Компоненты смеси антибиотиков могут быть разделены и выделены из ферментациойного бульона при применении самых различных способов вклю О чающих экстракцию растворителей, противоточное распределение по Крэгу, колоночную хроматографию или комбинацию этих способовПри экстрации антибиотиков из бульона можно поль зоваться различными органическими растворителями, такими как хлороформ, этилацетат и метилизобутилкетон. Экстракцию растворителей предпочтительно проводят путем двукратнои экстракции бульона при величине рН 7 при помощи объема растворителя, примерно равного 1/3-1/2 объема бульона, из которого желательно выделить смесь антибиотиков. В зависимости от применяемого объема бульона пользуются различным оборудованием, таким как делительные воронки, резервуары с мешалками и механическим бборудованием для экстракции, например, центрифужные сепараторы, которые дают возможность осуществить процесс экстракции.Рекомендуемый метод выделения и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключается в следующем: либо не осветленный, либо осветленный бульон доводят до величины рН около 7 и экстрагируют двумя порциями метилизобутилкетона, объем которых составляет от примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона. Экстракт в растворителе концентрируют в вакууме и концентрант обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе выпаривают досуха в вакууме.Твердые вещества подвергают противопоточному распределению по Крзгу (б тарелок) с,использованием 5 ч. толуола, 2 ч. этанола, 3 ч. водного фосфатного буферного раствора с рН 4,5. Разделившиеся слои образуют верхнюю и нижнюю фазы системы противоточного распределения. После распределения слои анализируют методом тонкослойной хроматографии. Разделенные Фракции выпаривают досуха в вакууме.Твердые вещества, содержащие депсипептиды, растворяют в хлороформе, обрабатывают активированным древесным углем, фильтруют и выпаривают в вакууме, Остаток, полученный после выпаривания хлороформа, растворяют в ацетоне, Твердые вещества, осадившиеся при прибавлении гептана, растворяют в небольшом количестве хлороформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до рН 6, изготовленную в присутствии хлороформа и н-пропанола, в соотношении 99:1 об/об. Колонку проявляют той же системой растворителей под давлением 5600 н/м . Отдельные участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии, Фракции, содержащие разделенные депсипептиды, объединяют, выпаривают в вакууме и содержимое их кристаллизуют из ацетона-гепатана.Фракции, полученные противоточным методом, содержащие макроциклические лактоны, объединяют, выпаривают в вакууме и твердые вещества растворяют в этилацетате. Раствор перемешивают с силикагелем, фильтруют и растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и производят осаждение гексаном, Твердые вещества разделяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют под давлением 5600 н/м на колонке силикагеля, забуференной до рН 6,0 и изготовленной в присутствии этилацетата.Для проявления пользуются системой из этилацетата тетрагидрофурана и гексана в соотношении 80:20:20. Участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии, Фракции, содержащие разделенные макроциклические 5 лактоны, объединяют и выпаривают в вакууме. Отдельные Фракции обрабатывают дополнительным противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной хроматографией с использовани ем различных систем проявителей.Тщательное контролирование каждой стадии очистки дает воэможность выделить индивидуальные макроциклические лактоны в достаточно чистом состоянии, так что фракции в растворителе могут быть выпарены досуха с получением чистых компонентов.А. ацгац 11 соГог АТСС 31011 по меньшей мере четыре депсипептида и по 20 меньшей мере четыре макроциклических лактона. Однако, первичными компонентами являются депсипептиды. Соединения 37 277 (основные) и 37 932 (побочные) и макроциклические лактоныСоединения 36 926 (основные) и 35 763 (побочные).Сырые смеси антибиотиков, получаемыенепосредственно иэ бульонаги очищенные индивидуальные компоненты 30 обладают широким спектром бактерицидных свойств.Максимальная синергетическая активность у комбинаций очищенных макроциклических лактонов и депсипептидов была достигнута при интервале соотно-, шений 1-2:1. Примерно такие же соотношения наблюдаются для ферментационных бульонов А. ацгацс 1 со Гог АТСС ,ц 31011 и для выделенных из них сырых смесей антибиотиков. Это открытие является противоположным тому, что наблюдается для других синергетических смесей антибиотиков, для которых синергетические факторы наблюдаются у Ферментационных бульонов и сырых смесей при суб-оптимальных соотношениях.50Антибиотик представляет особый интерес в качестве агентов усиления роста домашней птицы и животных из-эа их широкого бактерицидного спектра. Промотирующая рост активность сырой смеси антибиотиков опрецелялась на молодых поросятах в течение 40 дней.Средний дневной привес, потребление корма и эффективность оказалисьзначительно улучшенными (р с 0,01)по сравнению с неполучавшими антибиотиков контрольными животными(табл.1.)Сходные результаты были такжеполучены придаче индивидуальныхчистых Соединений 36 926, 27 932и 37 277 или смесей чистых соединений, приближающихся по своемусоставу к составу сырых смесейантибиотиков.Эффективность с точки зренияусиления роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыплятах, в корм для которых вводилиантибиотики. Значительное улучшение (р с 0,01) привеса по сравнению с не получавшими препаратаконтрольными цыплятами наблюдаласьдля цыплят, получивших в своейдиете антибиотики (табл. 2).П р и м е р 1. Одновременноцыплята-бройлеры, самцы однодневного возраста, породы Хаббард, получали кормовые рационы, содержащиебацитрацин (10 г/т ) виргинамицин(10 ч. на 10 ) и сырую смесь данныхантибиотиков, партия 1 (10 частейна 10 ) в течение 21-дневного6периода выращивания. Полученныеданные показывают, Что виргиниамицияи сырая смесь антибиотиков являютсяпо существу одинаковым с точкизрения улучшения характеристик запериод времени в 21 день, а данные,полученные при употреблении бацитрацина, оказались несколько худшими"Хаббард" были выбраны 360 цыплятдля проведения экспериментов. Послечетырехднейной выдержки цыплят взвешивали и разделяли на группы дляпроведения обработки, Цыплят отдельных групп взвешивали через3-7 дней (см. табл. 4. )Таким образом, приведенные данныесвидетельствуют о том, что предложенные препараты антибиотиков способствуют усилению роста животныхи птиц и вызывают эффективное использование корма по сравнению сдругими препаратами антибиотиков.751309 12 Таблица 1 0,35 2,5 Контро пыт (50иотиковорма) ант10 63 1,3 1 кг корма на 1 кг привесаТаблиц 5 93 трол пыт10 ч. антибиоиков на 10 ч. орма) 8 Табл 3 ез антибиотиковацитрациниргиниамицин 0 Сырая смесь предложенных антибиотиков а блица 4,6 Без антибиотиков ацитрацин (10 г/тиргиниамицин10 частей на 10 ) 93 Сырая смесь предложенных антибиотиков(10 частей на 10 ) 1,56 мула изобретения ия роста нежвачныхющий введение в антибиотиков, о т Способ усил животных, вклю корм препарато л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью повышения эффективности способа путем улучшения использования корма животными, в качестве препара-65 тов антибиотиков вводят смесь основ751309 14 Составитель Л. МураяТехреду,Ковалева Корректор И.МУска Редактор Д. Пинчук Заказ 4676 48 Тирам 569 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент , г. агород, ул. Проектная, 4 ного макроциклического лактона и депсипептида в соотношении 1:2-1,продуцируемую штаммом АсспорМадевац ганйсойог АТСС 31011,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе