Способ определения содержания белка

содержание белка;значение связывания красителя с белком;соответствующее этому связыванию значение концентрации 55 анализируемого препарата; 14939 тельно растирают в Фарфоровой ступке пестиком в течение 10 мин и высушивают при 105" С до постоянного веса (хранят препарат в стеклянном бюксе с притертой крышкой). Затем делают5 необходимую навеску препарата, добавляют 15 мл ацетона и перемешивают при комнатной температуре (см.табл.1) в течение 15 мин (см,табл,2) на магнитной мешалке, После этого суспенэию центрифугируют в течение 15 мин при 7000-8000 об/мин, ацетон удаляют декантацией, а осадок высушивают при комнатной температуре в течение 15 5-10 мин. К высушенному от ацетона препарата добавляют 0,01 н НС 1, рН 2 (см.табл,3,4) до концентрации препарата 5 мг/мл и перемешивают при комнатной температуре на магнитной 20 мешалке в течение 15 мин, Затем не прекращая перемешивание, разносят аликвоты суспензии по пробиркам,доводя объем до 1,5 мл с помощью 0,01 н НС 1, и добавляют в каждую пробирку 25 по 3 мл раствора красителя амидочерного 10 В 0,6 г/л в 0,01 н НС 1, Далее пробирки помещают в термостат и инкубируют при 60 С (см,табл,5) в течение 20 мин (см,табл,6) при пере мешивании, После инкубации Фильтруют все образцы и контроль (раствор красителя без препарата) через бумажные Фильтры на воронках. Фильтраты разбавляют в 25 раз, для чего к 0,2 мл Фильтрата добавляют 4,8 мл 0,01 н НС 1, а затем измеряют оптическую плотность П при 590 нм в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1,0 см против 0,01 н НС 1. Далее оп ределяют разницу й 0 между оптическими плотностями контроля и опытного образца, Связывание красителя с анализируемым препаратом (разницу между оптическими плотностями) выражают в процентах от оптической плотности Фильтрата контроля.Содержание истинного белка в продуктах микробного синтеза и биомассе микроорганизмов определяют по форму 50 леуС = - в в1003,Ах 52А и В - эмпирические коэффициентыуравнения калибровочнойпрямой (у=Ах+В), рассчитанные с помощью метода наименьших квадратов из нескольких параллельных опы-тов по связыванию красителяамидочерного 10 В со стандартным препаратом (биомассой микроорганизмов илипродуктом микробного синтеза), содержание белка в котором определено с помощьюизвестного метода, напримерпо Барнштейну или по даннымаминокислотного анализа.В табл,1 показано влияние температуры обработки ацетоном препаратакормовых гидролиэных дрожжей с кон- .центрацией 5 мг/мл на связывание красителя амидочерного 10 В с ними.В табл,2 показано влияние времениобработки ацетоном препарата кормовыхгидролизных дрожжей на связываниекрасителя амидочерного 10 В с ними,В табл.3 показано влияние рН раствора красителя амидочерного 10 В на егосвязывание с кормовыми гидролизнымидрожжами,В табл,4 показано связывание красителя амидочерного 10 В с кормовымигидролизными дрожжами в зависимостиот состава растворителя. В табл,5 показано влияние температуры инкубации кормовых гидролизныхдрожжей с красителем амидочерным 10 Вна его связывание с дрожжами.В табл,6 показано влияние времениинкубации кормовых гидролизных дрожжей с красителем амидочерным 10 В наего связывание с ними,П ри ме р. Первоначальным этапом оп"ределения белка по предлагаемому способу является определение эмпирическихкоэффициентов калибровочной прямой(у = Ах + В), т.е. зависимости связывания красителя амидочерного 10 В состандартным препаратом от концентрарии в этом препарате истинного белка,который определяли по Барнштейну,В качестве стандартного препарата дляопределения белка в биомассе микроорганизмов мы использовали кормовыегидролизные дрожжи с содержанием белка в расчете на сухой вес 41,427, Эмпирические коэффициенты А и В определяли по методу наименьших квадратов(см. табл, 7): Ях у,;-(.Е х;) (.Е ; ) Содержание белка в анализируемыхпрепаратах определяли по формуле у -029 35,63 х= 8,11где А и В - эмпирические коэффициенты калибровочной прямойх; - концентрация белка встандартном препарате;у - опытные значения свяэывания красителя с препаратом, соответствующие х;,И - число измерений.В табл,7 показано связывание красителя амидочерного 10 В со стандартным препаратом кормовых гидролизных дрожжей. 10 15 20 Содержание белка в анализируемыхпрепаратах определяли по формулеч - 8 11С = - -- а -- 100 30,07 хВ качестве анализируемого препарата взяли дрожжи (кормовые гидролизные) с неизвестным содержанием белка(см,табл,8),В табл.8 показано связывание красителя амидочерного 10 В с анализируемым препаратом кормовых гидролиз 35ных дрожжей,В результате проведенных расчетовполучили следующие значения содержания белка в анализируемом препаратекормовых гидролиэных дрожжей: 40С39991 С= 42,977.; С 3= 41,517.;С = 41,49 + 0,63 Х.Таким образом, содержание белкав анализируемом препарате кормовых 45гидролизных дрожжей составляет41,497Для определения содержания белкав продукте микробного синтеза в качестве стандартного препарата использовали дрожжеванную ржаную муку ссодержанием белка по Барнштейну10,62(см,табл,9) и белково-витаминный концентрат (БВК) с содержанием белка 55,137 (см,табл.11).В табл,9 показано связывание кра-сителя амидочерного 1 ОВ со стандартным препаратом дрожжеванной ржаной муки. В качестве анализируемого препарата мы использовали дрожжеванную ржаную муку (см.табл,10) с неизвестным содержанием белка.В табл.10 показано связывание красители амидочерного 10 В с анализируемым препаратом дрожжеванной ржаной муки,В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате:С,= 11,07%; С= 11,287.; С = 11,197; Сср= 11 ф 18 + 0107%Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате дрожжеванной ржаной муки составляет 11,187.В табл.11 показано связывание красителя амидочерного 10 В со стандартным препаратом белково-витаминного концентрата.Содержание белка в анализируемых препаратах белково-витаминных концентрациях определяли по формулеу С = ---- " 100 Х.27,09 хВ качестве анализируемого препарата испольэовали белково-витаминный концентрат (см,табл,12) с неизвестным содержанием белка,В табл.12 показано связывание красителя амидочерного 10 В с анализируемым препаратом белково-витаминного концентрата.В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате белково-витаминного концентрата: С, = 56,451; С = 55,88 Х; С= 55,96 Х, Сср= 56 э 10 + Оъ 24%Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате БВК составляет 56,10 Х.Формула изобретенияСпособ определения содержания белка, предусматривающий предварительную обработку исходного образца, добавление к нему красителя амидочерного 10 В с одновременным регулирова- нием рН среды, инкубирование, удале1493952 исходного образца и растворителя0,5-1,0, после чего ацетон удаляют,а инкубацию образца с раствором красителя проводят при 50- 100 С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, при этом добавление красителяосуществляют с установлением рН спомощью НС 1 в пределах 1-3.Таблица 1 ние осадка с последующим спектрофотометрическим анализом надосадочнойФракции и расчетом содержания белка,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности определениябелка, предварительную обработку образца проводят ацетоном при 15-55 Св течение 15-30 мин и при отношении Ю Время об- Температура Ри/п работки обработки,С мин Связываниекрасителя, Х 1 %23 15 4 15 .5 15 6 15 7 15 8 15 9 15 10 15 11 15 12 15 Контроль (раствор красителя беэ дрожжей). Опыт без предварительной обработки ацетоном.1,00 0,04 0,04 0,05 0,22 0,34 0,53 Оптическа плотность контроля не зависела от рН в исследованном диапазоне. 1 2 3 4 5 6 7 20 20 20 20 20 2020 0 5 10 15 20 25 30 40 50 55 5 10 15 20 25 30 35 1,25 0,76 0,72 0,64 0,55 0,51 0,45 0,46 0,48 0,48 0,51 0,51 1,26 0,76 0,71 0,56 0,45 0,47 0,49 0,48 0 56 О 0,96 0,96 0,95 0,78 0,66 0,47 0 0,49 0,53 0,61 0,70 0,74 0,80 0,79 0,77 О, 77 0,74 0,74 0 0,49 0,54 0,69 0,80 0,78 0,76 0,77 0 69 0 96 96 95 78 66 47 0 100,0 108,2 124,5 142,9 151,0 163,3 161,2 157,1 157, 1 151,0 151,0 0 100,0 110,2 140,8 163,3 159,2 155,1157,1 140 81493952 1 О Таблица 4 Концентрацияпрепарата, мг/мп УУ .и/и 0,01 н НС 1 Буферный раствор ф 0 63,30 54,20 45, 1 О 0 62,50 54,35 45,65 4,5 3,5 3,0 Буферный раствор содержал 37,65 г/л лимонной кислоты и 1, 136 г/л ИаНРО. Таблица 5+ Оптическая плотность контроля не зависела от температуры в исследованном диапазоне.Таблица 6 ВУ Температура Время ини/и инкубации, кубации,С мин Связываниекрасителя, 7 Таблица 7 Концентрация, мг/мл г белкаСвязывание красителяс препаратомЕ препаратаВ таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов,1 2 3 4 5 6 7 8 9 120 20 20 20 20 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 5,0 4,54,0 3,5 3,0 2,5 2,0 5 10 15 20 25 30 35 40 2,06 1,85 1,64 1,44 1,23 1,03 0,82 20 50 60 80 100 1,20 0,89 0,70 0,54 0,56 0,57 1,20 0,91 0,70 0,65 0,55 0,60 0,62 0,83 0,89 0 0,31 0,50 0,66 0,64 0,63 0 0,29 0,50 0,55 0,65 0,60 0,58 0,37 0,31 069, 10+1,2462,85 т 0,8758,25+1,3252,9510,8046,5010,7637,051,0033,08+1,03 0 25,8 41,7 55,0 53,3 52,5 0 24,2 41,7 45,8 54,2 50,0 48,3 30,8 25,81493952 12 Таблица 8 Связываниекрасителя, 7 Концентрацияпрепарата,мг/мл Ю и/и 00,56 062,22 0,90 0,34 0,34 0,40 0,44 0,50 0,48 4,5 4,5 3,5 3,5 3,0 3,0 0,34 0,48 53,33 45,56 0,42 0,41 0,49 Таблица 9 Связывание красителя спрепаратом ф, Х Юфи/п белка препарата фВ таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов,Таблица 10 Связываниекрасителя, 7 п,р Концентрацияпрепарата,мг/мл ФУп/и 035,679 00,34 0,61 0,68 0,27 28,42 24,21 0,23 0 72 блица 11В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов. 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 10 9 8 7 6 5 4 2,76 2,48 2,20 1,93 1,65 1,38 1, 10 1,06 0,96 0,85 0,74 0,64 0,53 0,42 0,95 0,60 0,62 0,68 0,680,71 0,73 038,49+1,04 34,46+1,00 29,87+0,68 27,09+0,29 22,44+0,34 19,00+0,37 15,98 ф 0,24 087,400,96 82, 1110,82 75,82+0,85 66,31+0,79 60,03 ф 0,61 53,72 ф 0,80 42,11+0,810,20 67,50 60,00 0,81 0,39 0,48 0,72 Редактор И.Циткина Заказ 4103/42 Тираж 789 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина, 101 4,5 4,5 3,5 3,5 3,0 3,0 1,20 0,19 0,21 0,40 0,38 0,48 0,48 Составитель В,Варламов Техред Л,Олийнык Корректор Л.Патай