Способ определения -глутаминовой кислоты

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союэ СоветскихСоцналнстнческнхРеспублик р 1910763(22) Заявлено 140480 (21) 2914254/23-04 1 Щ М. Кп.э с присоединением заявки Й 9 С 12 Ц 1/00 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(23) Приоритет РЗ УДК 543,9Всесо й научно-исследовательскрикладной энзимологии инсти 1 Заявите 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1 гГЛУТАИИНОВОЙ КИСЛОТЫ между конценткислоты н поИзобретение относится к биохимическому анализу, а именно к количественному определению Ь-глутаминовой кислоты, и может использоваться для контроля технологии и качества Ь-глутаминовой кислоты, для анализа пищевого и кормового сырья и продуктов.Известны способы энзиматическипотенциометрического определения Ь- глутаминовой кислоты, основанные на измерении выделяющейся двуокиси углерода СО селективным электродом 1).Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения Ь"глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом иа основе Ь-глутаматдекарбоксилазы. Выделяющаяся при этом углекислота вызывает изменение потенциала СО селективного электрода. Концентрацию Ь-глутаминовой кислоты определяют по калибровочному графику зависимости потенциала ст концентрации кислоты 2),Недостатками укаэанного способа являются большой расход водорастворимого препарата, Ь-глутаматдекарбоксилазы и недостаточно выраженная коли чественная зависимостьрацией Ь-глутаминовойтенциалом электрода.Цель изобретения - упрощение способа.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определенияЬ-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом на основе Ь-глутаматкарбоксилазы, иммобилизованной на силохроме,содержащем бромацетильные группы, с последующим потенциометрическнм измерением образующейся двуокиси углерода, з качестве энзима используют Ь-глутаматдкарбоксилазу, иммобилизованную на силохроме, содержащем бромацетильные группы,П р и м е р 1. Получение иммобилизованной Ь-глутаматдекарбоксилазы. В качестве носителя используют аминопропилсилохром СХ,5 с размером гранул 0,1-0,2 мм, Для введения бромацетильных групп 5 г носителя суспендируют в 40 мл диоксана, прибавляют 0,56 г бромуксусной кислоты и зквивалентное количество 0,83 г Н, И -дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 3 ч. По" лученный активированный носитель промывают диоксаном, водой и 0,1 М фос910763 фатным 5 уфернью раствором (рН 7,2) .Для иммобилизации используют препаратЬ-глутаматдекарбоксилаэы из Езсйег 1 с-Ма со 11 шт, 600, с активностью46 Е/мг белка (Е-мкмоль лмин ) . В40,0 мл раствора Ь-глутаматдекарбоксилазы (0,1 М фосфатный буфер, рН7,2, концентрация белка 6,26 мг/мл)суспендируют 5 г активированногс носителя, и смесь перемешивают н,:;качалке .18 ч при 4 С, Затем носитель 10со связанным ферментом промываютводой 1 М раствором БаС 2 и 0,05 Мфосфатным буфером (рН 6,0) . Активность иммобилизованного препарата1508 Е/г, выход по активности 65,5.Иммобилизованный препарат хранят вхолодильнике (4 С) в виде суспензии.в 0,05 М фосфатном буфере (рН 6,0),содержащем 0,026 мг/мл пиридоксальфосфата. 20П р и м е р 2, Методика определения Ь-глутаминовой кислоты,в котором смонтированы стеклянный и вспомогательный электроды, При этом шарик стеклянного электрода, предварительно покрытый тонким слоем элект-. ролита, остается отделенным от реакционной смеси воздушным зазором, Ь-глутаминовую кислоту декарбоксилиРуют ферментом, иммобилизованным на гранулах силохрома содержащего бром ацетильные группы. Выделяющаяся двуокись углерода растворяется в электролите, вследствие чего происходит изменения его рН, пропорциональное концентрации Ь-глутаминовой кислоты. Изменения рН регистрируют с помощью самопишущего потенциометра и цифрового вольтметра. Ь-Глутаминовую кислоту определяют по калибровочному графику, показывающему зависимость изменений рН электролита от концентрации Ь-глутаминовой кислоты, После анализа испытуемый раствор отфильтровывают, промывают Зх 2 мл 0,05 М буферным раствором рН 3,8, содержащим 5.10 М пиридоксальфосфат и 0,05 М МаСК, и анализируют другой образец, используя тот же ферментный препарат.Концентрацию (С)Ь-глутаминовой кислоты определяют по калибровочному графику или рассчитывают по Формуле, полученной преобразованием уравнения калибровочной прямой, Коэффициенты уравнения калибровочной прямой получены обработкой методом наименьших квадратов данных зависимости Ь рН от о С растворов Ь-глутаминовой кислоты с известной концентрацией (коэффициент корреляции 0,9997) .Уравнение калибровочной прямой рН - 3,239-0,914 Ио С.Концентрация Ь-глутаминовой кисло - 3,2 Ъ 9-дрНтм (моль/л) С:О -0914 Перед измерением в реакционную ячейку вносят 170 мг иммобилизованной Ь-глутаматдекарбоксилаэы (260 Е) . Исследуемый раствор. Ь-глутаминовой кислоты подготавливают установлением рН 3,8-4,0 0,1 Б-раствором НСВ или ИаОН и внесением ИаСЙ в таком количестве, чтобы конечная концентрация БаСЙ была 0,05 М. Блок электродов рН-метра помещают на вспомогательную ячейку, содержащую раствор электролита (0,005 М ИаНСОз, 0,005 Ы МаС 2 1 метилцеллюлозы и 0,1 Ъ твин), так, 35 чтобы шарик стеклянного электрода был полностью погружен в раствор. После уравновешивания электрода, избыток электролита с поверхности шарика удаляют при помощи полиуретановой 40 губки. Блок электродов переносят на реакционную ячейку, Измерение выделяющейся двуокиси углерода осуществляют обычным стеклянным Н+- чувствительным электродом, который 45 отделен от реакционной смеси воздушнща зазором. Исследуемый раствор помещают в ячейку и закрывают буоком,Коэффициент вариации метода9-2,3. Производительность 1012 образцов/час.В таблице приведены сравнительные технические данные по известному и предлагаемому способу. 6,0 (О, 2-10) 1,7 (0,4-3,0) Анализируется только Ь-глутаминовая кисло- та точ нос ть, Ъ (мг% ) Избирательность Отклик 1-3Заказ 1030/2 . Тираж 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРно делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5вееюав ФФилиал ППП фПате тф, г.ужгород, ул.Проектная,4 Иэ приведенных данных следует, что предлагаемый метод значительно превосходит известный по быстроте анализа, а уступает только по предегу обнаружения, Поскольку имеется практическая потребность в экспресс-анализе Ь-глутаминовой кислоты в микробиологичес 5 кой и химико-фармацевтической промьащ ленности, где приходится иметь дело с концентрациями порядка 0,1-3, меньший предел обнаружения не является., недостатком, Предлагаемый способ позволяет сразу анализировать более концентрированные растворы (до 1,5) беэ их разбавления, в то время, как по известному способу нельзя определять Ь-глутаминовую кислоту в раство рах с концентрацией более 0,01. При определении концентрации Ь-глутаминовой кислоты по известному способу расход фермента составляет в 2 О среднем 20 Е на анализ. В предлагаемом способе исходное количество иммобилизованного фермента (260 Е) может быть использовано для проведения минимум 1000 анализов. Кроме того, способ может быть осу"ществлен при исчользовании обычногорН-электрода.формула изобретенияСпособ определения Ь-глутаминовойкислоты путем обработки анализируемой пробы значимом на основе Ь-глутаматдекарбоксилаэы с последующимпотенциометрическим измерением выделяющейся двуокиси углерода, о т"л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения способа, в качествеэнзима используют Ь-глутаматдекарбоксилазу, иммобилизованную на силохромесодержащем бромацетильные группы.,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Уао 8. У. еС а 1. Рогеп 11 оае 1г 1 с йейегш 1 пае ой 2-д 1 иааХс апйругцч 1 с асЫз жеа епз 1 ва 1 е(ЫсагЬоху1 а 11 оп,. "В 1 ое 1 есСгосЬев В 1 оепегдф,1976, 3, р. 106-112.2. АЬп В.К. е а 1 А епз 1 ле е 1 ес-,Сгойе аког 1 Ье йегепп 1 па 11 оп ой БдеШав 4.с ас 1 Й. "В 1 ое 1 ес 1 госЬев.В 1 оепещ,ф, 1975, 2, р.142-153 (прототип) .