Способ определения происхождения животных

О П И С А Н И Е(1)743654ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик68524930-;4 5 22) Заявлено 20.11.78 (21 6 ицецием заявки М с прис Государствеиныи комитет СССР. Романов, А, Г, Тимченко, Ои И. А. Балахнин Н. Зряко 71) Заявители Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ и Опытная станция мясного скотоводства Украинской сельскохозяйственной Академии(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯРОИСХОЖДЕНИЯ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в племенном животноводстве для уточнения происхождения сельскохозяйственных животных.Известен способ иммуногецетцч еского определения происхождения сельскохозяйственных животных по группам крови с помощью серологических реакций с применением моцоспецифических сывороток 1),Одцако существующий способ определе нця происхождения животных не всегда дает возможность идентифицировать материнство цли отцовство, так как даже при наличии одинаковых эритроццтарных антигецов делается вывод о вероятцом, а не ,инстицном родстве. Способ требует обязательного семейного анализа, и прц ошибочных записях матерей определение происхождения приплода становится практически невозможным, 1 Лспользованце иммунологического тестирования животных по группам крови ограничено огромными масштабами племенного животноводства и трудностями, возникающими при получении большого набора моноспецифцческлх сывороток,Известен также способ определения происхождения сельскохозяйственных животных путем генетического анализа специфическцх полцморфных белко крови руемой пары потомок - родитель 12,Однако известный способ це обеспечивает необходимой степени надежности опре д:лецця происхождения животных.Цель изобретения - повышение надежности установления истинного происхождения племенных цлц иных сельскохозяйственных животных.Поставленная цель достигается предлагаемым способом, в котором генетический анализ проводят с ацтигенами гистосовмсстцмостп в реакции смешанных лимфоццтов, причем лимфоциты родителя предварительно ццактцвируют.В способе применяется одноцаправленцая реакция смешанных лимфоццтов, которую в настоящее время широко используют при подборе донора в трансплантаццонцой 20 медицине. По предлагаемому способу совместно культивируют лейкоциты периферической крови приплода и одного из предполагаемых родителей. При этом клетки последнего ицактчвируют одним из известных 25 способов (например, облучением, митомицинам-С ц т. д.). В этом случае реакция возможна лишь со стороны лимфоцптов приплода и то при условии чужеродности тестируемого родителя. Реакция учитывается микроскопически плп радиометрическцзо включенио меченного предшественника з нуклеиновую кислоту, например, Н-ТРмигена. Отсутствие реакцци свидетельствует, ;то ддццос животное действительно являтся матерью цли отцом приплода, наличие эсдции цсклОчдет отцовство илц мятсринтво.П р и,м с р. УстаОвлеЯце пропсхОждснця животного складывается из следующих :тапов работы: взятие проб крови, получение лейкоцитов, цняктивации лейкоцитов предполагаемого родителя, постановка реакции и сс учет.Кровь берут из яремной всцы и стерильные пробирки в объеме 4 - б,ег от ка 5 кдого животного, Для предупреждениявептыгяция крови в пробирки предварительно вносят стерильный раствор гспарцча цз расчета 40 ед. на 1 лг,г крови. Кровь нсооходимо брать от приплода, предполагаемого родителя и для контроля от жиОторос заведомо це может быть з б чцзком родстве с приплодом.Кровь доставляют в лабораторию и по;си;ают в тсрмостат на 37 С, Т 1 срсз 1,5 н 0 . бР 111 ют и гззм 5, содср ка 1 цую ли 11 лО циты, и разводят се подходящей срсдогл, :Зпримср средой 199, тяк, чтобы в 1 ллодсржался 1 лллн лейкоцитов.Лейкоциты предполагаемого родит.ля цоцтро;ьцого 5 лглготгОго ццактцгцруют мцгомиццном-С. Для этого к 1 мл суспсцзци :леток дсбавляют 30 лнг митсмццццд-Г месь ццк,бПуют 30 .;.ггн цд воля юц Одцс лрц 37 С. После этого клетки трижды отмывают средой 199 и вновь разводят среЕой;О концентрации 1 глглг.Культивирование клеток производят влилеоцизированных стеклянных пробирках размером 16 Х 125 ллл. Реакциго проводят то следующей схеме:1, 1 лглн клеток приплода в 3 .г среды 99, содержащей 100 ед. пенициллина и 00 ед, стречтомицинд в 1 л.г 1 для опрсдс- СНЦЯ ФОНОВОЙ ДКТЕ 1 ВПОСТЦ КЛСТОК,.2. 1 лгллг клеток приплода - 500000 .:Енактцвировднных клеток контрольного жц:отного в 3 лгл среды того же состава (по- ОРКЦТЕЛЬПЫРЕ КОНТРОЛЬ) .3. 1 лг.гн клеток прцплодд в500000нактР 1 вцровзпных клет 05 теструсъгоч ро-,цтеля при тех же условелях.Для каждого варианта ставят по 3 цааллсльных пробы, Смсшанныс культуры :нкубируот в стерильных условиях в тсростате при 37 С в плотно закрытых про- .5 ир к а х.Через 5 суток в культуры стерильно добавляют Н-тимидип в дозе 0,5 лгкКОри/ггл в 0,1 лгл среды 199 и культивировагцгс лродолжают еще 24 н.Культуры после этого охлаждают ца ,Сдяной базс и уровень включения изотопа определяют с помощью жидкостного сцин"иляционного счетчика любым полход 5 пщлг методом, например опрегслснцсм радцоактцвгцостц,кислотонерастворцмо: о осадка, егерсцесснцого на миллипоровые фи;ьтры.Результат выражают з колцчествс цмггуль сов радиоактивно;о распада в минуту наробу. Прц этом определяют среднее зна:сццс тр х параллельных проб, После этого Оцрсдсляот индекс реакции (ИР) по фор- МУ,Ес.Ои;оц,;якВг:;с: ь ггЕсгкс.гьттг11 Рзь ,Е,.;цс.с ст и .,: .03Рл х к 1 л ьу."акция счцтается положительной при1 Р 1 лаццом 1,б ц Въгшс. Результаты реакции учитываются лишь прц зца;енин ИР ч."шс 4 в пробах цг п 0,105 цтсг 1 ьн 1 Й контроль.Рсдкцця между клетками грцплода и 20 .ПактВцровацнымц клетками истинногоОдНтеля всегда отргщдтсльна (ИР меньшеб) 51,:гдооорот. Оцд Все,Ез положиСл- на (высокие значения ИР) црц см;ш.зя:ПЕ неродственных лимфоццтов..о исдлагзсмам способу проводятэкспертизу происхождения бычков 1. телок ;,бср ПРЕ-ангусского скота. Полу снцыс данные сравнивают с заключением экспертПзы по группам крови. До постановки реакции 30 С:гццгц.ц.ЕХ ЛЕМфОццтО.Е цетц.НОС ПрОцСхгж сццс ц ро;Ествсцц 110 Отцоц 1 снЕя 1 сс пру; мых пар це цзвссг, 3 дкгючснцс обоих ЭКСПСРТПЗ СОПОСТЗВЛЯОТ С ЗЯЦЦС 51 МЦ В П.Сц ы.; книга.:.г" Результаты уста.Овлсция про:Схождсцця . животных приведены в табл, 1, а в т:Ебл. 2 ц 3результаты смешдгНых лцмфоццтов при тестрованеи зацс.егмо;,остц"ьх 1;:1;огствецгых цдр,4011 сцользовдцце предлагаемого способа0; 10:СЛСЦЦ 5 ГтРОЦСХОжл НЦЯ СЕЛЬСКОХОЗЯй". ц;ч 11: х жц Нотных Обсспсч цваст пос д цен:О с существ)ющцмц способами г ".ела ЕОце прсцгЕуцгествз:Опрслс,51 стся нс всроятнос, д цстиццссотцовство (матерРгнство); не требуется се- Мй ЦЫ 1 Д ЦД; ЦЗ, Т. С. ПОВЫШЗСТСЯ ЦД;1 СЖ. Сгть Сцсцкц ироггсхогкдепця; ц кроме того, 50 . Гпсб с 1 СЯ пгППОтоп 1 Сцця дорогост 051 ЦЕЦХ МОЦОСГЦЕЦЦфЦЧЕСКЦХ СЫВОРО.Формула цзобретецияГггособ опрсдсленця происхождения живца ных. Включающий генетический анализ дцтцгецов тестируемой пары; потомок - родитель, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с 60 целью повышения надежности определенияпроисхождения, гснстцОскгиР андлцз проводят с дцтцгсцамц гцстосовместцмости в реакц;и смешдццьЕх ле.;Ег 10 ццтов, причем лЕъгфоце 1 ты ро;еЕтсля прелварцтс,"гьно пцак т;вцр уютРезультаты реакции мешанных л, х фоцитовБ х Б кс.О Заключениеэкспертизы по реакции смешан, ных лимфоцитов Происхождение но записямЗаключение экспертизы по группам крови,Родители н(ьСгЕс й ПредполагаемыйотецПредполагаемаяматьПотомок Отцовствоне подтвержденоМатеринствоподтверждено Бутан Бутон 1,02 0,91 12,8 и материнство не исключ а 1 отся,Теленок рожден от других родителей (провокацион, проба) ПредполагаемыйотецПредполагаемая10,5 Бутон 1 1,2 132 330 11,5 ПредполагаемыйотецПредполагаемаяиатьПотомок Лотос ОтцовствоисключеноМатеринствонолтвсрждается 1 Бутан326730 Отрицаетсяодни из родителей 10,3 23,3 685 326 730 1,6 Таблица ЯРезультаты реакции смешанных лчмфоцитов прн тестировании заведомо родственныхи неродственных пар крупного рогатого скота Тестирование заведомо известных родителей и потомков Тестирование неродственных пар включение Нз-тимиднна в гробахспонтанноевключениеНз.тимидина спонтанное включениеНз-тимидина включениеНз-тнмидинав пробах индексреакции индексреакции ияи/ иин и,ии, мин 1 2 8 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 183 20 201 383 383 213 213 260 260 502 360 140 150 511 511 329 329 283 28397 97 181 181 321 321 450 450 204 261 302 345 613 215 298 664 236 430 540 168 240 662 715 428 296 339 396 ,126 136 163 272 354 417 405 675 1,1 1,3 1,5 0,9 1,6 1,0 ,4 1,4 1,9 0,85 1,5 1,2 1,6 1,1 .1,4 1,3 0,9 1,2 1,4 1,3 1,4 0,9 1,5 1,1 1,3 0,9 1,5 84 84 437 437 180 180 360 360 411 502 360 140 150 511 511 329 329 283 283 97 97 97 97 1247 2012 501 84602 2168 3315 5384 3671 152 1152 1395 3270 4957 4507 2065 2972 2341 524 671 843 890 14,8 "3.91,5 10,5 5,0 4,3 6,0 9,2 13,1 7,3 4,2 8,3 9,3 6,4 9,7 13,7 6,6 10,5 8,2 5,4 6,8 8,7 9,2: а оо сс о с го с сс д ла ф о хо ОС Сг о.а,2 оо с) с," г) 2ао ф х Г со о о х с" о х х о ф о,ох сс гс ххд о ф х хо,9. со о Ж сд сс х сох у сс ) с;1 Сс У ф г,) о, с х) х о с: сл хх оа с оЗ Д х х сб Д х о м м сх о х ф о о о о а Ы г, о а х )а )а ср -г ас:)сГС охащо фЯС У,хо ,ф фо асфМсс) Ооуохс с)оогс хойо ыа ссоа х о о хс.) с о ф а сса о -ф ,о о о оо О о иитиеэй иоиИ, ,= нпк(ии пои Н ЕНИ) ИСИЗ, - ,ЦЗИЭЬОГИЦ нпи.и еииг к иЗ.-СН Эйд 1 с О 1 Г Г И Н .ИИ Е.с11:.с-( - ооо ьс ООВ Е2 о о Б сс со со со соо о сб 1 о о о л л с; И а о сосо осто оСс ссо,оосо =.,ЯФяс-г-дсЕ Х со ссо 3. осЧ сО сс сосч ся ос сососО ссасоЙ с 1сосо ооо осо о о о с-ж сЮ С- ю-ч -ч= , с,сд;с . Фсосоя .сои сО 1-сясам Юс сос 4 ясД-Я -.Оя Дд су я -д сосЗ ос Я я 1 тс.с О О сЗ с Ф Г со со со сз сОсо-сОс - . с г ссо соотг с с )ИЯ сососф с 1 сф Р о.чФ ЮсЧ фс ООРог,о атщ Хсс1ссао,ох схос743654 12 Составитель Л, Мурзя Техред Л, (уклина Корректор С. Файн Редактор А. Соловьева Заказ 681/883 Изд, М 324 Тпрахк 729 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, )1(.35, Раушская наб., д. 4/5 Тип, Харьк, фил. пред. Патент Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;1. Авторское свидетельство СССР Лоо 330842, кл. А 01 К 67/00, 1972,2. Эйдригевич Е. В. и Лапкина М, М, Генетические методы определения происхождения сельскохозяйственных жлвютных, Киев, Урожай, 1975, с. 19 - 27.