Способ получения делипилизированной сыворотки крови животных

(33) С 1 А ссср Опубликовано 15,05, 82.бюллетень 18 до делам иэобретеиий и открытийДата опубликования описания 15.05.82 иностранцы Энглис Рей 9 риггс и Джек Миттзн-Хрис.,(С 111 А)(72) Авторы изобретения Иностранная фирма"Е.И, Дюпон де Немур энд компани"(Б 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЛИПИЛИЗИРОБАННОН СЫВОРОТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии.Известен способ получения делипилизированной сыворотки крови животных путем смешивания сыворотки с канионообменными смолами 11 1.Однако известный способ не обеспечивает высокой степени делипилизациии отделения электролитов от сыворотки. 1 ОЦелью изобретения является повышение степени делипилизации и отделение электролитов от сыворотки,Эта цель достигается тем, что приосуществлении спосоЬа получения де- Илипилизированной сыворотки крови животных путем смешивания сыворотки санионообменными смолами, смешиваютсыворотку крови с анионо-катионообменными смолами, доводят рН до 4,95, 5, отделяют надосадочную жидкость,доводят рН надосадочной жидкостидо 3,0-5, О, выдерживают надосадочную жидкость до снижения ферментативной активности до 1-3 НЕ/л. 25 При этом рН надосадочной жидкости доводят до 6, 7-7, 6 путем добавления 2-амино-оксиметил,3-пропандиола.Способ осуществляют следующим образом,Цельную кровь, взятую от донора,помещают в пробирку и выдерживают вней без встряхивания. Через несколько минут происходит свертывание(коагуляция ) крови и образование кровяного сгустка.Затем эту кровь подвергают центрифугированию с целью уплотнения об"разовавшегося кровяного сгустка иотжима из него жидкой сыворотки, номожно оставить образец на несколькочасов в обычных условиях, в течениекоторого сгусток медленно сжимается,уплотняется и выдавливает из себясыворотку, которую затем отделяютот сгустка декантацией,Для получения делипилизированнойСыворотки контролируют и регулируютконцентрацию катионов или анионов, 928995 ф45 50 55 присутствующих в сыворотке, которую предстоит обработать. Для полного об мена анионов и катионов необходимо использовать достаточное количество смешанной ионообменйой смолы, а также контролируют рН. Величина рН соответствует изоэлектрической точке липопротеинов, обычне присутствующих в сывороткеДля достижения снижения велицины рН, вызывающего осаждение липопротеинов из сыворотки одновременно с ионным обменом, необходимо использовать избыток катионообменной смолы, т,е. необходимо, чтобы в используемую смешанную анионо- катионообмен-, ную смолу был введен избыток катион- обменной смолы. Это избыточное коли чество катионообменной смолы определяют путем титрования данного объема сыворотки, например 25 мл, разбавленной (1,00 М ) соляной кислотой до рН 5,0. Объем кислоты, пошедшей на титрование, обозначают как титр сыворотки и, зная этот титр, используют соответствующее количество катионообменной смолы.Для получения делипилизированной ,сыворотки используют замороженную человецескую сыворотку, Ей дают оттаять. при 32 - 3 С, используя водяную баню. Оттаявшую сыворотку осматривают, нет ли в,ней .видимых признаков липемии или гемолиза, т.е, сыворотка должна быть прозрачной и практически бесцветной. Если сыворотка визуально выглядит красной или розовой по цвету или мутной на просвет, то эта сыворотка непригодна для использования. Кроме того, сыворотка не должна содержать патогенных мик роорганизмов.При смешении ионообменной смолы и сыворотки осуществляют постоянный контроль за изменениями величины рН. В первые несколько минут после прибавления смолы к сыворотке величина рН увеличивается по сравнению с первоначальной до 9,0 - 10,3. Для снижения рН и удаления ионов из сыворотки обычно используют .избыток смешанной ионообменной смолы с тем, чтобы компенсировать некоторое уменьшение эффективности смолы, вызванное отложением липопротеинового осадка на поверхности гранул смолы в процессе преципитации липопронтеинов.1При необходимости к сыворотке добавляют в 1,45 ф 0, 15 раз больше по 5 1 О 15 го 25 ЭО 35 40 сравнению с теоретически вычисленнымколичество смешанной ионообменнойсмолы,После того, как рН достигает5,2 + 0,3 это обычно занимает 815 мин); перемешивание смеси ионообменной смолы и сыворотки прекращаюти надосадочную сыворотку (супернатант) отделяют от смолы и выпавшихв осадок липопротеинов. Отделениесупернатанта от осадка осуществляютлюбым известным способом, таким какФильтрование, декантация отсасывание надосадочной сыворотки,Величину рН сыворотки, отделеннойот осадка, доводят затем до 4,0 1,0добавлением соляной кислоты, цтобыобеспечить низкую ферментативную активность в сыворотке. Желательно,чтобы активность фермента креатинкиназыКК ) не превышало 3 ИЕ/л.Для этого сыворотку выдерживают прирН 4, 0 + 0, 2 в течение длительноговремени, цтобы обеспечить полное завершение денатурации. Этот процессконтролируют, периодически проводяанализ сыворотки для определения активности КК, Эту сыворотку можно оставить на ночь,на хранение при конечном значении рН, если хранить ееопри 4 С, рН сыворотки доводят доконецного значения, равного 1,3 + 0,3,путем добавления подходящего буферного раствора, такого как 2-амино 2-оксиметил,3-пропандиола.Эту делипилизированную сывороткуможно хранить длительное время в замороженном состоянии или при 4 С втечение 48 ч 1 без добавления микробных ингибиторов). Эту сыворотку можно использоватьдля клинических анализов,П р и м е .р. Приготовление смешанной анионо-катионообменной смолы.Универсальную высокоемкую сильнокислотную катионообменную смолу"Дуолит 6 РС" и высокопористуюсильноосновную анионообменную смолу"Дуолит 6 РСн смешивают между собой, полученную смесь тщательно перемешивают с целью гомогенизации всмесителе до получения гомогеннойсмеси, которую можно хранить в геометично закрытых сосудах или контейнерах для предотвращения изменения воздушно-сухого веса и нежелательного взаимодействия с атмосферной двуокисью углерода,928995 формула изобретения зО 1, Способ получения делипилизированной сыворотки крови животных пу"тем смешивания сыворотки с анионообменными смолами, о т л и ц а ю -щ и й с я тем, цто, с целью повышения степени делипилизации и отделенияэлектролитов от сыворотки, смешива"ют сыворотку крови с анионо"катионообменными смолами, доводя рН до 1,95,5, отделяют надосадоцную жидкость,доводят рН надосадочной жидкости до3,0-5,0, выдерживают надосадоцнуюжидкость до снижения ферментативнойактивности до 1-3 ИЕ/л.2. Способ по и. 1, о т л и ц а ю 45ц и й с я тем, что рН надосадочнойжидкости доводят до 6, 7-7,6 путемдобавления 2-амино-оксиметил,3 пропандиола,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. А,Моща. 51 щц 1 сакеоы Оесегв- пас 1 оп оГ 5 егов СЬо 1 еэсего 1 1 п Н 1 с 1 Ьадд ои Оепысу 1 роргосе 1 пэ, - "С 11- п 1 са 1 Сйея, 1978, чй 21, р. 1501.55 50 ВНИИПИ Заказ 3289/78 Тираж 717 Подписное После этого приготавливают сыворотку крови человека.Выход делипилизированной сыворотки при использовании настоящего способа составляет примерно 80 - 854 отисходного ее обьема. Поэтому для получения желаемого конечного .колицества сыворотки, где исходная сыворотка хранится в замороженном состоянии,берут приблизительно в 1,25 раза 1больше количество исходной сыворотки. Эту сыворотку быстро размораживают, выдерживая на водяной банеОпри 32 - 37 С, После осмотра оттаявшей сыворотки на предмет выяснения, 1нет ли признаков каких-либо изменений, таких как окрашивание (гемолиз)или помутнение (липемия), сывороткупомещают в полиэтиленовую емкостьдостаточного размера, 2Получение делипилиэированной сыворотки.К 32 л оттаявшей сыворотки, рНкоторой 7,5 - 8,0 и не обнаруживаю-щей никаких признаков окрашивания в 2красный или розовый цвет и никакихпризнаков помутнения, прибавляют8,96 кг смешанной ионообменной смолы, приготовленной на предыдущейстадии, одновременно быстро перемешивая смесь. Изменение рН прослеживают с помощью электродов, помещен,ных в реакционную смесь, После того,как рН достигает 10,1 (через 1,5 минпосле начала реакции) оно начинает.медленно падать и достигает 5, 15(по истечение 12 мин), По истеченииэтого времени перемешивание смесипрекращают и дают возможность смоле и выпавшему осадку липопротеиновотстояться, после чего надосадочнуюделипилизированную сыворотку удаляют отсасыванием. рН полученной делипилизированной сыворотки доводятдо 7,3 добавлением 2-амино-оксиметил,3-пропандиола. Так как порошкообраэный амин растворяется в сыворотке довольно медленно, то при егоприбавлении и растворении необходимо перемешивание смеси.Делипилизированную сыворотку можно хранить при 1 С в течение 18 ч,если возникает необходимость хранитьее более длительное время, то сыворотку замораживают,6Получение контрольного материалаосуществляют путем добавления к 5 лполученной сыворотки. 1250 ИЕ очищенного СКИВ-изоэнэима при комнатной температуре.Полученный таким образом контрольный материал, обладающий определенной ферментативной активностью, может быть лиофилизирован для сохранеО. ния этой ферментативной активностии может храниться в виде лиофилизированного препарата до тея пор, покаон не потребуется,В этом случае его используют в5 виде восстановленного в прежнем виде раствора в качестве контрольногоматериала для клинического анализа,Восстановленный после, лиофилизациив виде раствора материал может бытьО разбавлен до любой желаемой концентрации дилипилизированной сывороткой,полученной предложенным способом.Предложенный способ позволяет повысить степень делипилизации и отде 5 ление электролитов от сыворотки.