Патентнотgt; amp; л11чеп; д 5 f: 5aoycka

Зависимый от патентаМ. Кл. 6 01 п 21/22 аявлецо 24 Х 11,1968 ( 1260079/23 Приоритет 1.1967,656032, США еламотк цтир Комитет по д наобретений и р при Совете Министро СССРДК 543.42,062(088.8) убликовацо 02,1,1972, Бюллетень6 блцковяция описация 29.111.1972 ат Авторыизобретеци Иностранцы Вильям Дрелл и Перси Луис Гербер(Соединенные Штаты Амершси) Ицострацца фирма Смит Клайн энд френч Лабораторнааявит СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭТИЛОВО СПИРТА В ТКАНЯХ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ2 определсх оргациз- матерца 1 цамиддо- егидрогиного хант, связыкарбазцд.чедчощей Известцыи способ количественного ция этилового спирта в тканях живы мов состоит в обработке исследуемых лов смесью, в которую входят цикот дениндицуклеотид (НАД), алкогольд паза (АДН), буффер, реагент основ рактера, стабилизатор, а также аге вающий альдегид, например сем Фермецтативцый метод осцовац ца с химической реакции: С 2 Н"ОН+НАД СНзСОО+ НАДН+ 11+. Превращение спирта в ацетальдегцд идет до конца при условии, что последний продукт связывается и реакция осуществляется в щелочном растворе. В присутствии адекватцых количеств алкогольдегидрогицазы (АДН) эта цол окисляется в ацетальдегид с образованием восстановленного НАД, который поглощает свет при длине волны 340 лтлк. Измерение количественного изменения в поглощении светя позволяет вычислить количество спирта, превращенного за время анализа, и таким образом определить его концентрацию.Ранее используемые агенты для связывания НАД, например семикарбазид в виде соли хлористоводородцои кислоты (ХН 2 - СО -- ХН - ЫНз НС 1), имеют тот недостаток, что оци образуют комплексы с НАД, которые впоследствии препятствуют фермсцтативцому определецшо в связи с тем, что комплексы могутпортиться при старении, давая неправильныефотометрические показатели,5 С целью устранения указанного недостатка,а также сокращения времени анализа и повышения .его точности, предлагается в качествеагента, связывающего альдегид, применятьямицооксиялкацовыс кислоты, которые имеютО от 2 до 5 атомов углерода, или амицооксиалкацсульфокислоты, имеющие до 4 атомов углерода.Скорость переходя водорода в реакции НАДс этацолом является функцией цескольких5 факторов в реакционной смеси. Когда все факторы црисутству 1 от в оптимальных количествах, эта скорость зависит прежде всего от скорости удаления ацетяльдсгида. Реакция протекает медленно, когда В качестве улявливяющеО го агента используется семикарбазид, Времядо конца реакции с семикарбазидом составляет 30 - 60 лтин. Обнаружено, что аналоги гпдроксиламица способствуют значительно болеебыстрому протеканию реакции. Например, в5 реакционной смеси, содержащей 0,035 мольамицооксиуксусцой кислоты, реакция идет 5 -15 мин в зависимости от количества присутствующего этанола. В этом и состоит преимущество предлагаемого способа - сокращениеО времени реакции без потери точцости, особец25 Всего 1039,6 но тогда, когда требуются частые и быстрые анализы спирта.Алкогольдегидраза (АДН) является одним из менее стабильных энзпмов, поэтому лиофилизацпя энзима обязательна,Стабилизация эпзпма.Уменьшение потери активности до минимума во время лцофилпзацци и после достигается суспецдцровацпем кристаллического энзима в растворе, который содержит стабилизирующие и актпвирующие вещества, например:Вода, мл 100 Камедь акации, г 5,0 Никотпнамид - аденцновыйдинуклеотид, лгг 15Хлоргидрат цистеина, мг 50Глицин, г 1,5 Альбумин, г 1,0 Трис-версоловая буффернаясмесь при рН=8, мл 5,0Ллкогольдегидр аза 100000. Данный раствор тщательно сушат прп температуре ниже 0 С и затем переносят в обезвоженцую атмосферу. Потеря активности прц этом составляет меньше 10%,Предпочтительными агентами, связывающими альдегид, являются аминооксиалка новые кислоты, особенно аминооксиуксусная кислота. Онп очень устойчивы при однородном смешении с реактивными компонентами. Кроме того, найдено, что аминооксиалкаповые кислоты можно использовать в более широком диапазоне концентраций по сравнению с семикарбазидом.Реактив, применяемый для анализа этанола в тканях живых организмов, состоит из сухой смеси следующих веществ:Энзим алкогольдегидраза Буфферпая смесь пирофосфат, соль щелочного металла Стабилизатор глицин и альбумин Агент аминооксиуксусцаяулавливающий кислотанейтрализующий карбоцат натрия Коэнзимникотицамид-адеццновый дицуклеотид. Первая стадия приготовления реактивной смеси заключается в определении количества нейтрализующего агента, например карбоната натрия, нужного для нейтрализации кислотности новых улавливающих агентов. С этой целью готовят две смеси, которые включают следующие химические вещества, мг:Высушенный пирофосфат натрия 400 Аминооксиуксусная кислота 200 Глицин 100 Альбумин 27. Каждую смесь растворяют в 27 мл дистиллированной воды и определяют количество безводного карбоната натрия, необходимое для доведения раствора до рН 8,8 - 9,2. Затем 35 40 45 50 55 60 65 это количество карбоната натрия добавляют ко второму раствору и снова измеряют рН с целью проверки. Количество безводного карбоната натрия, обычно требуемое для получения необходимого интервала рН, составляет около 280 мг для вышеописанной смеси.Вторая стадия состоит в определении алкогольдегидразы, которую вводят в объединенный реактив. Это определение можно сделать любым методом, описанным в литературе, причем активность АДН устанавливается в международных единицах (М, Е.) на 1 мг лиофилизированного энзима, Необходимо такое количество энзильного препарата, которое бы обеспечивало активность порядка 200 М.Далее готовят опытную партию в зависимости от количества карбоната натрия и АДН, определенных вышеуказанным способом. С этой целью в сухом виде смешивают следующие ингредиенты (их однородность достигается размалыванием), мг:Пирофосфат натрия 400 Аминоксиуксусная кислота 200 Глицин 100 Альбумин 27 Ллко гол ьдегидр аз а (200 М. Е./мг)Никотинамидадениновый динуклеотид 31,6Карбонат натрия 280 Для подтверждения пригодности данной смеси для анализа этилового спирта в биологических жидкостях часть порошка весом 110 - 120 мг полностью растворяют в 2,6 мл дистиллированной воды в оптической кювете со световым пробегом 1 см. Для того чтобы установить уровень активности, создаваемой самими реактивами, т, е. реактивной пробой, кювету помещают в фотометр, допускающий измерение поглощения света при длине волны 340 ммк, Поскольку реакция прекращается, когда все вещество (а именно спирт) прореагировало, нет необходимости поддерживать постоянной температуру в кювете.Однако для качественного контроля при производстве данного продукта полезно сравнивать активности различных партий при одной и той же температуре. Для аналитических целей выбирают температуру 30 С, хотя можно использовать любые температуры между 25 и 37 С. Кювету, содержащую реактивный раствор, оставляют в фотометре, и измеряют поглощение пРи 340 ммк 30 мин с интервалами 5 мин. Удовлетворительная реактивная смесь будет показывать поглощающую способность, которая увеличивается со скоростью не больше, чем 0,001 в 1 мин для пробы.Далее реактивную смесь испытывают с помощью анализа эталона этилового спирта.Эталон представляет собой абсолютный этиловый спирт, разбавленный дистиллированной водой до концентрации около 0,2 вес. %/объем. Для анализа стандартный раствор этанола328604 10027 Предмет изобретения 40 45 50 Составитель И. Антипова Текред Л. Куклина Корректор Л. Царькова Редактор Л. Ильина Заказ 547/17 Изд. ЛЪ 200 Тираж 448 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете гМинпстров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 4,5 Сапунова, 2 Типография, пр. разбавляют 49 частями дистиллированной воды. Порцию реактивного порошка весом 110 - 120 мг растворяют в 2,7 мл дистиллированной воды для использования в качестве реактивной пробы. Вторую порцию 110 - 120 мг растворяют в 2,6 лгл дистиллированной воды. Разбавленный спиртовой стандарт (0,1 мл) добавляют к последнему раствору, смешивают и оставляют стоять около 5 мин, Фотометр устанавливают ца цуль, снимая показания на месте с реактивной пробой. Затем измеряют поглощение стандартного раствора. Эти стадии повторяют с интервалами 5 мин до тех пор, пока два последовательных показания стандарта не будут отличаться на 0,005 или меньше.Обычно реакция заканчивается за 10 лгигг. Конечное показание поглощения является численно равным содержанию спирта в весовых - объемных процентах. Выход спирта должен быть 100+ 10 добавленного количества для удовлетворительного анализа.Окончательно реактив готовят из двух смесей следующего состава, г:Первая смесьвысушенный пирофосфат натрия 400 аминооксиуксусная кислота 200 карбонат натрия безводный 280Вторая смесьглицинальбуминалкогольдегидраза лиофилизированная 1. Оба порошка затем объединяют и смешивают для получения гомогенной смеси. Количество данного порошка (1,1 г) растворяют в 30 мл дистиллированной деионизированной воды и измеряют рН. Для данного анализа удовлетворительным интервалом рН является 8,8 - 9,2. Активность раствора устанавливают с помощью анализа спиртового стандарта, как описано выше. Законченный реактив в сухом порошкообразном виде готов для упаковки в единицы, каждая из которых обеспечивает все реагенты, необходимые для одного анализа спирта, при растворении в 2,6 л,г воды,Пропорции или количество компонентов реактива, предназначенного для использования, можно изменять, так как изобретешге скорее включает новое сочетание ингредиентов, чем какие-либо критические пределы. АДН, например, должна присутствовать в количестве, до 5 10 15 20 25 Зо 35 статочном для окисления всего спирта, который необходимо определить. То же самое относится к другим компонентам реактива,Ферментативную оценку спирта можно применить ко всем тем системам, которые содержат или выделяют этацол, не тормозят активности АДН или не препятствуют поглощеншо света при длине волны 340 лг.цк. Так, данный анализ можно использовать прц оценке активности трцпсцна, Трппсцц гидролцзует субстрат - бецзоил-аргцнинэтпловый эфир. Скорость выделения спирта, измеряемая по реакции АДН, будет мерой, активности трипсица. Аналогичным образом может определяться активность других энзимов, таких как протеазы или эстеразы, которые выделяют этанол, пропанол или бутанол.Аминооксисоедцнения, например аминооксцуксусная кислота, также имеют значение как агенты, связывающие альдегид и в других ферментативных анализах. Конкретным примером является определение молочной кислоты, Когда объединяют лактат дегидразы, НАД и аминооксиалкановую кислоту с подходящим буферным раствором, стабилизатором ц нейтрализующим агентом, как описано выше, получают удобный реагецт для количественного определения молочной кислоты, Аналогично можно анализировать р-оксимасляную кислоту замещением Р-оксибутирата дегидразы вместо АДН.Все варианты анализа, согласно изобретению, включают превращение коэнзцма из одной формы в другую, что сопровождается оптическим поглощением при определенной длине волны. Способ количественного определения этилового спирта в тканях живых организмов обработкой исследуемого материала смесью цз никотинамцддодегпшдцнуклеотцда, алкогольдегидрогицазы, буффера, реагецта основного характера, стабцлцзатора, связывающего альдсгцд агента с последующим спектрофотометрическпм анализом, отгичаюигийся тем, что, с целью сокращения времени анализа ц повышения его точности, в качестве связующего альдегцд агента берут амццооксцалкацовые кислоты, имеющие от 2 до 5 атомов углерода, цлц амиггооксиалкансульфокислоты, имеющие до 4 атомов углерода.