Способ размножения вирусов гриппа

союз советскихсоциАлистическихР ЕСПУ БЛ И К. ОСУДАРСТВ ЕННОЕ ПАТН.ПНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) ИЗО ПИСАН ЕТЕНИ 54) С ГРИП 57) И лог известВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(72) Г.Н.Поезжалова и Р.А,Дорошенко (56) Регламент производства вакцины гриппозной, химической, адсорбираванной жидкой. Утв. 26 мая 1987 г, Уфимский Н ИИВС.Гогбаидзе Г.А., Курашвили В.Е. Влияние переменного низкочастотного магнитного поля на репродукцию некоторых вирусов и процесс интерфероноабразооания. Тезисы докл. ХИ съезда микробиологов и эпидемиологоо. М.: 1979, ч,З, с.35. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вирусологии, и мажет быть использована в практической работе со штаммами вирусов гриппа для получения высокопродуктивных вариантов,Цель изобретения - повышение титров вирусов гриппа.: . Предложенный способ заключается о том, что на 10-11 дневные куриные эмбрионы, культуры кле гак или свежетрипсинизираванные взвеси клеток почек сирийского хомяка воздействуют постоянным электромагнитным полем (пост, ЭМП) в дозах 100- 5000 3 о течение 5-40 мин или колеблющимся электромагнитным полем ЭМП 1000-5000 Э в течение 10-35 минут с периодом колебаний 50-60 с. Затем производят заражение куриных эмбрионоо или выросших культур клеток одним из штаммоо вирусов гриппа, инкубируют их о термаста.ьгЦ ио 1 782990 А 12 й 7/00, А 61 К 39/145.2ПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЙ ВИРУСОВ ПАспользование: вирусолагия; иммуноСущность изобретения: систему для ожения вируса (куриные эмбрионы, ры клеток куриных фибробластов или ь свежетрипсинизированных клеток хомяка) обрабатывают электромагми полями; постоянйым с напряжено 100-5000 3 в течение 5-40 мин или еннь 1 м с напряженностью 1000-5000 чение 10-35 мин с периодом колеба- -60 с. Обработку проводятдо заражеирусом. Титры вирусов гриппа чиоаются на 1,03-4,8 логарифма р, 2 з.п.ф-лы, 1 ил., 8 табл,культу взвес почек нитнь НОСТЬ перем Энте ний 50 ния о увели ЭИД 5 те при температуре (35 + 1) С и собирают вируссодеркащую жидкость известными способами, В ней определяют гемагглютиеиий нирующие и инфекционные титры. Предло- "4 женный способ осуществляют в следующих Об вариантах,В а р и а н т 1. Воздействие на куриные эмбрионы постоянного электромагнитного паля (пост,ЭМП) разной напряжениости,ОКуриные эмбрионы(КЭ) помещаютмежду полюсами электромагнита в вертикальном положении тупым концом вверх на какой-нибудь подставке, например из пена-ф пласта или полиуретана. Воздействие ЭМП осуществляют в течение 5-30 мин. В качес 1- ве контроля служат КЭ, помещенные за пределами воздействия поля. Затем производят их заражение вирусам,После заражения "омагниченные" и контрольные эмбрионы инкубируют20 титров вирчсаВ этом варианте досгигнуто также увелИчение титров изученных штаммовв "предельных разведениях" (10 -10 ) (см.25 табл.4),Б а р и а и т 2. Воздействие постоянногоэлектромагнитного поля на культуру клетоккуриных фибропластов.П р и м е р 4. На монослой выросшей30 культурьг клеток куриных фибропластов(Кф) воэдейству 1 от постоянным электромаг-,нитным полем в дозе 1000 Э в течение 5, 10,15 и 30 мин. Пробирки с культурой подвешивают между полюсами магнита или укрепля 35 ют на подставке. После опыта питательнуюсреду сливают, клетки отмывают от следовсыворотки и производят заражение вирусным штаглмом А/Ленинград/0139 (Н 2 М 2) смножественностью заракения 0,1 ЭИД;,о на40 клетку. Через 1 ч адсорбции вируса его сливают и вносят среду репродукции, например 199, Контролем служат пробирки скультурой клеток, зараженные вирусом, помещенные за пределами воздействия поля,45 Зараженные клетки культйвируют втермостате при твлпературе 35"С,делал сборы вируссодержащей жидкости (ВЖ) черезкаждые 2-3 дня. На 5-й день мейяюг средурепродукции.В ВЖ определярот гемагглю 50 тинирующие титры с %-ной взвесью зритроцитов кур и инфекционные - заражениемкурийыи эмбрионов. Результаты приведеныв табл,5, Как видно иэ табл,5; достигнутоувеличенгле титров вируса АИенинград/0139 в культуре клеток КФ, выдеожанной в постоянном электромагийтйом поле10-30 глин.В;а р и а н т 3, Воздействйе колеблющегося электроглагиитного поля (колеб.ЭМП)на свежетрипсинизированные клеткй почек Иэ прйведенных примеров можно сдел"а 1 ь следукщие выводы, Й ьгдерживание куриТГьгхг эмбрионов в постоянном 55 элейгромагнитнай поле в течение 5-30 мин в дозе 100 - 5000 Э позвблило увелйчйть ти грь-изученньгх штагллов вирусов гриппа, Время экспозиции и напряженность полл ,9 йг достиже 1 гия максимального эффекта. ным способом и отсасывают аллантоиснуюжидкость.П р и гл е р 1, Пост, ЭМП напрякенноСтью 100-5000 Э. Время обработки 5 мин.Вйрусный штамм-рекомбинант Х 53-А (Нсвиной, Ь 1). Обрасотку полем проводятспо."обом, оп.1 сангщи выше, после чего эаража 1 от вирусом опытные и контрольныеэмбрионы,Гематглютинируощие титры определены в реек геглагглютинации с 1%-нойвзвесью эритроццтов кур, Инфекционныетитры наКЭ вычислены по Риду и дейчу,Резуль гаты этого опыта приведены в таблице 1.Средние данйые титров рекомбинантного вируса Х 53-А после "оматничицания"кури 1.гыхэмбРионов пост, ЭМП" разной напряЖенкости представлены в табл,1,Как"видно из табл.1, достйгнуто увеличениетитров вируса привсех значениях поля с Максимумом в дозах 4500 - 5000 Э.П р и м е р 2, В опыте используют низко п родукти в н ы й. штамм А/ В и ктория/Зб/72, применяя пост,ЭМП 1000 Э приразличном времени воздействия. Эти даннйе приведены в табл.2.Уак видно иэ табл,2, наблюдается увеличениЕ титров. вируса гриппа А/ВикторияпРиобработке в течение 10-30 мин,,П р.и м е р 3, Опыт проводятаналогичнопримеру"2, используя рекомбинантныйЙтаммвируса гриппа Х-А(Н свиной, йг 1),Результаты приведены в табл.З,, В данной примере наибольший эффектгголучен при воздействий постоянного магЙЙтнОГО поля на куриные эмбрионы в течвйие 5 мин.При определении инфекционных титРов пОставлена разверйутая реакция гемагглъотицации . с вируссодержащимйатеРиалом каждого эмбриона, РезультатыЙрйведены в табл,4.Из табл.4 видио увелйчейиб гемагглютйниру 1 ощих титров в алантоисной жидкости омагничегных эмбрионов. ТакимобразоМ, йри экспозиций куриных зглбрионов в постоянном электоомагнитном полейа первом пйссаже достигнуто увелй ение- тйтрбв в предельных разведениях на втор огл пассаже. были различными в работе с раэньв;и штаммагли,Так, у рекомбинанта Х-А кратность йрироста ГЕ-тйтров была и 2-6 раза, инфекционных на 1,5-3,1 логарифма ЭИДБО при экспозиции в поле 5 - 10 мин с максимумом эффекта в 1000-5000 Э (см. табл. 1, 3).У ниэкопродуктивного штамма Н 2 М 2 (А/Виктория/72) ГЕ-титры увеличивались в 2 раза, инфекционная активность на 1-2,0 логарифма.В опытах были использованы такжештаглглы А/Техас/77 (НЗЙ 2), А/Киев (Н 1 К 1),получены аналогичные результатыБремя от обработки куриных эмбрионов до их заражения не влияло на титры вируса, Как правило, эффект "омагничивания" сохранялся длительное время. Следует отметить, что сильные поля 7000 и 10000 Э не приводили к дальнейшему увеличени оП р и м е р 6. Проводят обработку взвеси ляклеток ПСХ колеблющимся электромагнитным полем с последующим культивировани- увем двумя разными способами - мстационарнымв матрасах) и в вращающих- туся сосудах (роллерным). Для заражения бокультур клеток используют штамм вируса 55 стА/Киев/5979 (Н 181). Множественность за- эмражения 0,05 ЭИДьо/клетку.ньПосле экспозиции взвеси клеток, их роразделяют на две порции. Одну вносят в (а сирийского хомяка (ПСХ) в дозах 1000-4000Э с периодом колебаний 50;60 с, в течение10 - 35 мин.П р и м е р 5, Колеблющееся электромагнитное поле 1000 Э, Время обработки 10 и15 мин. Свежетрипсинизированные клетки 5ПСХ распределены по пробиркам в количестве 6 мл и подвешены в свободном состоянии между полюсами стационарногоэлектромагнита. Контролем служат пробирки с клетками за пределами воздействия 10поля, Затем клетки суспендированы с питательной среде Игла с 10;6 сыворотки и распределены по ростовым сосудам.Выращивание стационарным способом.Клетки культивируют в термостате до образования монослоя, после чего заражают вирусом гриппа описанным ранее способом(см.с,1). В данном примере использованыштаммы А/Ленинград/0139 (Н 2 И 2) и А/Техас/77 (НЗМ 2). Множественность заражения 0,005 ЭИДю на клетку. Сборы ВКЖсделаны на 3,4-е сут и на 3-е сут после сменысреды (второй урожай вируса). В матрасикахс клетками, обработанными магнитным полем, на сутки раньше появились признаки 25интенсивной репродукции вируса, проявляющееся в специфическом ЦПД,На чертеже представлена графическаяхарактеристика электромагнитного колеблющегося поля, используемого в данном варианте (период колебаний 50 с).Как видно из чертежа, напряженностьполя возрастала с 0 до 1000 Э в течение 25с и снижалась до 0 в последующие 25 с, чтоусиливало биологическое действие его на 35клетки.В табл,6 части "А" приведены средниевеличины титров вируса А/Ленинград/385/80, в части "Б" табл.6 - титры вируса А/Техас/77 в культуральной жидкости 40клеток почек хомяка, Из таблицы 6 отчетливо видно увеличение титров обеих вирусовпо гемагглютинации в 1,3-2,6 раза в первомурожае и в 8-16 раз во втором, Инфекцион. ные титры при этом увеличились на 0,7-2,2 45логарифма ЭИДпо и на 1,25-3 логарифмасоответственно во втором,стеклянные матрасы и культивируют стационарным способом.Вторую помещают в роллерные сосудыи культивируют нэ аппарате "Ролласелл"(США) со скоростью 0,5 об/мин, После образования монослоя их заражэрт вирусом пообычной схеме. Посевная доза в роллере -1 млн.клеток/мл (см. табл.7),Таким образом, обработка колеблющимся электромагнитным полем свежетрипсинизированных клеток почек хомякапозволила повысить титры изученных штаммов. Положительный эффект оказался наиболее выраженным в работе с вирумиА/Ленинград/0139 (Н 2 М 2) (табл.6).В а р и а н т Ч. Использование колеблющегося электромагнитного поля для обработки куриных эмбрионов с последующимзаражением их вирусами гриппа,П р и м е р 7. Проводят обработку 10 - 11дневных КЭ колеб,ЭМП 5000 Э с графической характеристикой, указанной на чертеже. Затем по обычной схеме их заражаютвирусом гриппа А/Техас/77 (НЗМ 2), Времяобработки полем 10, 20 и 30 мин, Результаты титрования приведены в таблице 8,Как видно из табл.8, достигнуто увеличение титров вируса А/Техас/77 после экспозиции куриных эмбрионов в колеб.ЭМП5000 Э.Следовательно, поставленная цель достигнута - увеличены титры (и соответственно репродукция) изученных штаммоввирусов гриппа, при использовании электромагнитных полей найденных характеристик: постоянного и колеблющегося - наразных биологических системах, источниках репродукции - куриных эмбрионах ипервичных культурах клеток.Следует отметить, что разные штаммыразмножались в "омагниченных" системах снеодинаковой интенсивностью. Для достижения максимального положительного эффекта необходим подбор параметровопытным путем.Метод прост и для достижения данногоспособа могут быть использованы любыестационарные электромагниты, позволяющие получить в зазоре между полюсами понапряженностью до 10000 Э.Применение данного способа позволителичить титры вирусов гриппа при рэзножении их в куриных эмбрионах или кульрах клеток, получать варианты штаммов слее высокой продуцирующей активноью, а также экономить расход куриныхбрионов и сырья для получения первичх культур клеток за счет увеличения титв в вируссодержащих жидкостяхлэнтаисной и культуральной),1782990 Таблица 1 Та бл Зависимость титров вируса А/Виктория/36/72 (Н 2 й 2)от времени ээмбрионов с пост, ЭМП 1000 Э ии куриных Таблица кции рекомбинантного штамма Х 53-А по ния КЭ пост, ЭМП 1000 ЭПоказатели лепр Формула изобретения 1. Способ размножения вирусов гриппа, включающий обработку электромагнитным полем куриных эмбрионов или культур клеток, их заражение, инкубацию и сбор вируссодержащей жидкости, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения титров вируса, на куриные эмбрионы или культуры клеток воздействуют постоянным электромагнитным полем с напряженностью 100- 5000 Э в течение 5-40 мин или переменным электромагнитным полем 1000-5000 Э с периодом колебаний 50 - 60 с в течение 10-35 мин.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что при использовании в качестве куль туры клеток куриных фибробластов воздействуют постоянным электромагнитным полем.З.Способпо п.1,отличающийсятем, что при использовании в качестве куль туры клеток свежетрипсинизированных клеток почек хомяка воздействуют переменным электромагнитным полем.1782990 10 Таблица 4 лРазвернутая реакция гемагглютинации с алантоисной жидкостью вируса Х-А при определении инфекционныхтитров.на КЗ- 10.5 по 10. =разведения вирус 2) и т,д. - номера пробирок с а и чание. нтоисной жидкостью 5 Табл иппа А/Леннг обработки ее 0139 (Нгг) в куЛьтурет,Э 11 П 1000 Э,Репродукция клетокруса г КФ посл раапичн нялн репро ка) 5 втор ци Логрифм ГЕ/н Кратность прироста"Ло Е/мп х) Е/ Титры ЛогарифнЭИДа,Время экспоэнции(мин) ЭИ 4,6 0,4 н е е 3,0 Не 1 ет 510 4 7 5,4 7 1 б 2 128 8 б,г6,7 2,5 б 15 30 32 16 3 т нтрольннеч енагглатиннруквихнфекцнонных тдтровлятровлогарифм ЭИД ть прироста ИЕ.л 11Фм ЭИ, кон Х) 11 ог Таблицаб ад/01394/Техас/77авеси руссе гриппа 4/Ленин х ОСХ, обработанных в кцнонные титры ед видкостн клет колеб.ЭПП л лглотирусине и ин в внруссодерв редине г 2 нруса 10 репродук л лллл Логарнемт,л / Кратностприроста генагглп тиннрущл окае ил ит" щх титров П ЭЛаьнм;лога рнемэцЛ 4 7,11 8,23 3,57 3,7 о 816 7,52- 16 Е,УО 1,18 г Е,7 О 1,18 25 Е,оО О,Е 64 3264 2 61 2 32 64128 2 107 . 1, 64 Комтрол1 О20ЭО 2,3 12 6 О 1,6 1,5918 7,30 Э 2 64. 2 64 2 7,20 8,07 8,76 7190 л1,Эглб 3,2 1,6 53 64 Гг 64 0,87 1,56 0,70 8,50 9,50 8,50 20 30 Кратность прироста нФекционных,т ров,логариФн л 42 ума 1 тн лога ривнОпяаы Кратност прироста генаггг тннруп- Ых тнт" ров латость ГЕ/илприростамнфекинонных титров,лога рнФм Кратностьприростагена гтв"тынрукавтитров 1 Кратностьприростеннфекционных титров,логарнемЭЛуклегарь 11окд1782990 таблица 7 Репродукция вируса гриппа А/Киев/5979 в культуре клеток ПСХ обработанных колеб. ЭПП вееввееввввеееевв ациона ее Роллерннй ва ввв аЛога ГЕ нл рат- ость ър но ЭИД, при рост 107 1,6 128 2 256 4 6453 22 92 64 2,6 9,5 12 З 5,З 9,77,З Конт родааааав ее вв е в в е Таблица Ф/Техасс/77 после обработки КЭ колеб. Эразличное время е 5000 итры в П ри меча н ие. " Кратность прироста ГЕ-титров; 1 Кратность прироста инфекционактивнос Составитель Г. БорискинаРедактор С. Кулакова Техред М.Моргентал Корректор ар Заказ 4490 Тираж Поаписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж-ЗБ, Рауаская наб, 4 У 5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагари Кратноприроста Логари 1 нЭПЛ / ттьта