Способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики

(51)5 С 12 И 15/83 РЕСПУБЛИ ГОСУДАРСТВЕННОЕВЕДОМСТВО СС(ГОСПАТЕНТ ССС РЕТЕН К Изобретенинженерии исельском хозяка. Известнык вирусу табачтабака путемк ВТМ сортов енетическои ользовано В ивании табая устойчивых М) растений ствительных видами табаие относится к может быть исп йстве при выращ методы получени ной мозаики (ВТ скрещивания чув с устойчивыми ПИСАНИЕ СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт общей генетики им. Н.И,Вавилова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА, УСТОЙЧИВЫХ К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ Однако при этом имеет место случайное наследование различных генов обоих родителей у потомства и теряются выгодные со четания генов, влияющих на ценность того или иного сорта. Этого недостатка лишен метод введения в растения генов путем генетической трансформации, поскольку в этом случае в растение передается лишь небольшая последовательность ДНК, включающая один или несколько генов и не нарушающая генетического баланса растения.Другим важным преимуществом этого метода является возможность введения в растение генов из чужеродных организмов, с которыми невозможно осуществить поло 2(57) Использование: в сельском хозяйстве при выращивании табака. Сущность изобретения заключается в том, что в ген растений табака вводят ген с -интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения М. 1 аЬасцв с помощью генетической трансформации растений методом лйстовых дисков плазмидай рбч 2260, регенерации на селективной среде растений, экспрессирующих человеческий интерферон, и определяют устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозайки. все скрещивание. И наконец, эти гены можно вводить в растение в составе таких векторов, которые обеспечивают требуемую интенсивность и регуляцию экспрессии вводимого гена. Описан способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к ВТМ, основанный на введении в растительный геном гена, кодирующего белок оболочки данного вируса, подставленного под контро-, ля сильного растительного промотора.Однако, данный способ не обеспечивает полной защиты от вируса, а дает лишь задержку в появлении симптомов вирусного заболевания при заражении ВТМ, и, кроме того, защитный эффект в этом случае наблюдается лишь при низкой концентрации вируса, осуществляющего заражение.Описано защитное действие на растения человеческого интерферона в отношении ряда вирусов, в том числе и ВТМ.Однако оно было показано лишь дляслучая экзогенной обработки интерфероном растений1782991 30 40 устойчивость в ВТМ 50 Цель изобретения - получение трансгенных растений табака, Устайчивых к вирусу табачной мозаики.Способ предлагает введение гена рекомбинантного а-интерферона человекапод контролем промотора вируса мозаикицветной капусты в растения К. таЬасце спомощью генетической трансформациирастений методом листовых дисков, регенерации на селективной среде растений,зкспрессирующих человеческий интерферон,.и определение устойчивости трансгенных растений к вирусу табачноймозаики,П р и м е р. Для трансформации растений й. аЬасцгп используют штаммы АдгоЬастегца тцпетасепз С 158 ВОЯ, содержащие "разоруженную" Т-плазмиду рОЧ 2260, интегрированную с рекомбинантной плазмидой рЗТ 20. Плазмида рЯТ 20 представляет собой экспрессианный вектор рЗТ 6 со встроенным: в экспрессианную кассету пад контроль промотора 35 Я вируса мозаики цветной капусты гена рекамбинантного а -интерферана человека. Вектор содержит также ген неомицинфасфотрансФеразы 11, обусловливающий устойчивость трансФормированных растений к канамицину. Трансформациа растений табака осуществляют методом листовых дисков следующим образом. Бактерии, выращенные в минимальной среде А 10,5 г/л К 2 НРОд, 4,5 г/л КН 2 РОл, 10 г/л (КН 4230, 0,5 г/л цитрат натрия - 2 Н 20, 0,5% глаказы, разводят средой ЯММО до плотности 10 кл/мл и погружают о полученнуа суспензию кусочки листьев табака сорта Самсун; выращенного в асептических условияхна 3 мин, Кусочки листьев промокают фильтрооальнай бумагой и переносят на среду для органогенеза и . инкубируют в светотроне 3 недели, Высшие побеги осторожно. вырезают и памецают на среду для укоренения и инкубируют еще 3 недели да укоренения побегов. Укоренившиеся на селективной среде с канамицином растения табака проверяют биохимйческими методами на наличие й зкспрессию гена интерферона, Присутствие вставки гена интерферона устанавливают методом дот-гибридизации. Тотальную ДНК, выделенную из растений, денатурируют и наносят на нитрацеллюлозный фильтр, после чего проводят иммобилизацию ДНК на фильтре и гибридизацию с Р-меченнойзгДНК гена интерферона. Растения, дающие гибридизационный сигнал содержат вставку гена интерферона.Транскрипцию гена интерферона в растениях определяют методам ноузерн-гибри дизации, Тотальную РНК выделяют изтрансгенных растений, фракционируют о денатурирующем агарозном геле с Формальдегидам, переносят на нитоацеллюлозный фильтр и гибридизуют с ) 10 "2 Р-меченной ДНК гена интер 6 рана. Отранскрипции гена интерферона судят по появлению зоны гибридизации, соответствующей молекулам РНК с размерам 0,95 т,о.8 случае контрольных растений табака, не подвергавшихся трансформации, гибридизация с ДНК гена интерферана не наблюдается.Синтез интерферана в трайсгенных растениях устанавливают с помощью метода иммунафиаоресценции. Используют монокланальнье антитела против лейкоцитарнага интерферана человека. Препараты готовят из листьев, растирая их в ступке и зкстрагируют буферам (25 мМ трис-НС рН 8,35; 195 мМ глицин). Препараты центриФугируют, 5 мин при 12000 аб/мин, к супернанту добавляют зтанол до конечной концентрации 20% и пропускают через нитрацеллюлозный фильтр. Проводят реакцию с монаклональными антителами против лейкацитарнага интерферана человека, промываат фильтр и осуществляют реакцию с меченными антителами против 90 мыши. Фильтры освещают длинновалновым УФсветам и фотографируот через зеленый светафильтр, При продукции растениями интерферана наблюдается свечение препаратов под УФ-светом. Растения, продуцирукщие интерферон, исследуют на.У растений о возрасте 2-3 мес берут листья и инфицируют их ВТМ отирая суспензию вируса в концентрации 1 мкг/мл в 100 мкл Фосфатного буфера рН 7,5 стеклянным шпателем о лист. Через 10 мин пооерхнасть листа промывают дистиллированной водой, промокают Фильтровальной бумагой и помещают во влажную камеру в темноте в подвешенном состоянии, где инкубируют 3- е сут при 25 С. В.качестве контрольных берут растенйя М. таЬасцв сорта Самсун, дающих системную инфекцию при заракении ВТМ, и гибрида Терновского, образующих локальные некрозы при инфекции ВТМ. Через 3-е сут на устойчивых к ВЧМ листьях табака гибрида Терновского образуются четкие лакал ьныенекрозы, в то время как на,листьях чувствительного к ВТМ табака сортаСамсун некрозоо не наблюдается. Листья трансгенных растений табака сорта Самсун,1782991 Составитель Т. ЗабойкинаТехред М.Моргентал . Корректор М. Шарови Редактор Заказ 4490 ТиражПодписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4 Я Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул Гагарина, 101 зкспрессирующие лейкоцитарный интерферон человека, при заражении ВТМ образуют локальные некрозы, похожие на некрозы, возникающие на листьях табака гибрида Терновского. Реакция локальной некротизации у трансгенных растений свидетельствуют об усилении активирусной защиты у данных растений. Введение и экспрессия гена лейкоцитарного интерферона человека в растения И. таЬасоа, чувствительных к ВТМ, приводит к индукции устойчивости к данному вирусу. Формула изобретения:Способ получения трансгенных растенийтабака, устойчивых к вирусу табачной мозаики, предусматривающий трансформациюрастительного материала, регенерацию его5 на селективной среде, укоренение и вмращивание побегов, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения устойчивости растений табака, в качестве растительного материала используют листовые диски табака10 а трансформацию проводят с помощью агробактерий, несущих плазмиду рОЧ 2260 сгеном интерферона человека,