Способ определения бактерицидной активности тканей

(51 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзный Курганский научный центр(56) Клемпарская Н,Н., Алексеева О.Г Определение бактерицидных свойств кожи у человека,- Ж.мед, радиологии, 1959, М 3, с. 70-72.:Каплан А.Е, Бактерицидные свойстватканей при травме. - Ж. ортопед, травмат, ипротезир 1982, М 4, с, 33-35.Никитенко В,И., Бухарин О.В;, Никитенко И,К, Диагностика, лечение и профилактика воспалительных осложнений утравматологических больных под контролем факторов естественной резистентно, сти. Методические рекомендации, Оренбург, 1983, с, 4-5,Авторское свидетельство СССР1 Ф 1355243, кл. А 61 В 10/00, 1984.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ТКАНЕЙ Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, и может быть использовано в клинической ортопедии и травматологии для лабораторного определения показателей обеэзараживающей активности тканей и оценки на этой основе течения чрескостного остеосинтеза на различных его этапах.Известны способы определения бактерицидных свойств тканей, которые основаны на подавлении роста тест-культуры на агаровых апликаторах, снятых с поверхности кожи, либо путем подавления роста тест- культуры в жидких средах. Однако эти ТЕНИЯ ф,2(57) Использование: изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в клинической ортопедии и травматологии для лабораторного определения показателей антимикробной активности тканей на этапах лечения методом чреСкостного остеосинтеза. Целью изобретения является повышение точности определения и расширение функциональных возможностей. Сущность изобретения: методика предусматривает забор тканевых компонентов, помещенйе их на газон одновременно со стандартным диагностическим диском с антибиотиком и по сопоставлению зон задержки роста тест-культуры определяют уровень бактерицидной активности в эквиваленте антибиотика, Положительный эффект: способ точен и прост в исполнении, не требует наличия дефицитных реактивов или дорогостоящей аппаратуры, Применение способа при чрескостном остеосинтезе яв-ляется важным лабораторным тестом, подтверждающИм условия благополучного течения остеосинтеза. известные способы позволяютопределять бактерицидные свойства только кожи кровй и ее компонентов,Известен также способ диагностики заживления послеоперационной раны, который на основе выявления зон задержки роста тест-культуры на агаровом газоне, позволяет диагностировать наличие или отсутствие начального этапа воспалительного процесса в послеоперационной ране.В случае неблагополучного течения процесса заживления послеоперационной раны в свежем раневом экссудате происходит разрушение факторов неспецифической резистентности в результате протеазной активности размножающихся гнаеродных бактерий, При этом действие известного способа строго ограничено сроками эпителизации раневой поверхности. В силу этого, известный способ не позволяет оценивать обеззараживающую активность тканей в условиях многомесячного длительного процесса чрескостногоостеосинтеза и, практически, полного отсутствия раневых повреждений. Кроме того, известная методикане позволяет получать конкретные показатели уровней обеззараживающей активности тканей в эквивалентах антибиотиков и на этой основе производить объективный прогноз течения остеосинтеза,Целью изобретения является оценка течения остеосинтеза путем определения показателей абеззараживающей активности тканей.Указанная цель достигается тем, что в способе включающем забор биологического материала на диск фильтровальной бумаги, размещение исследуемых проб на стандартном агаровом газоне микробной культуры, ее термостатирование и определение размеров зон задержки роста тест-культуры, одновременно размещают диски содержащие стандартные количества антибиотика и после получения, соответствующей, для данного антибиотика зоны задержки раста тест-культуры, сопоставляют ее с зонами у исследуемых проб, исходя издиапазона средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации используемого антибиотика рассчитывают уровень обеззараживающей активности тканей в эквиваленте антибиотика и при получении средних или.высоких уровней эквивалента обеззараживающей активности тканей диагностируют благополучное течение, а при отсутствии или низком уровнях такого эквивалента - неблагополучное течение остеасинтеза,Способ осуществляется следующим образом: у больных с артопедо-травматологической патологией, лечащихся методами чрескостного остеосинтеза, начиная с 4-6 дня после операции и на протяжении всего периода лечения компрессианно-дистракционным аппаратом и создаваемых им условии напряжения растяжения или напряжения сжатия, осуществляют забор тканевых компонентов. В качестве тканевых компонентов могут быть использованы: тканевая жидкость из спицевых каналов, разрезов и трещин кожи, реплики-отпечатки со свежих разрезав ткэней, суспензии тканеоых гомогентов при биопсии и др, Забирают исследуемые компоненты тканей с расчетом фиксации мх стэндэртного копи 55 используемого диска с антибиотиком, так и стандартности применяемого микробного газона тест-культуры,Отклонения от указанных показателей зан задержки вокруг дисков г. избранными антибиотиками указывают нэ та, что либо10202530354050 чества в каждой пробе путем засасываниявсегда с одинаковым абьемом диском из фильтровальнай бумаги диаметром 5 ммИсследуемые пробы помещают на поверхность также стандартного агароваго газона любой микробной культуры, продуцирующей каратиноидный пигмент из семейства Мсгососассеае рода Мсгасосснз, Если исследование выполняат на микробном газонесостоящем из тест-культуры семействаМсгососассеае то необходимо предварительно тщательно подобрать такую ее микробную нагрузку для газона, чтобы в конце выращивания достигались бы постоянные результаты при замере зон торможения.вокруг исследуемых дисков. Как правило, эта достигается при несплашном росте колонийтест-культуры в массе газонаТрадиционно, в качестве такой микробной тест-культуры используют Мсгососсцз Узосесссиз по отношению роста которого тарировали диаметры задержки роста,Одновременно на этот же микробный газон помещают стандартный диагностический диск с антибиотиком, например, мономи цинам, эритрамици нам илипенициллином.Исследуемые пробы с компонентамитканей и диагностический диск с избраннымантибиотиком, помещенные на микробныйгазон; термостатируют на протяжении 48 ч, После этого в первую очередь замеряют образовавшуюся зону задержки роста тест- культуры вокруг диска с избраннымантибиотиком. При этом, диаметр этойзонызадержки, если все компоненты газона стандартны, должны быть типичными именно для этого антибиотика. Так например, многократно выполненные исследованияна стандартных агаровых газонах с тест- культурой М с гососс аз Узабестс Оз концентрации 250000 клеток в мл при заливке на поверхность агара показали, что для диагностического диска, содержащего па ГОСТУ 30 мкг мономицина диаметр зоны задержки роста тест-культуры составляет всегда 22 мм. Для диска, содержащего по ГОСТУ 16 ЕД пенициллина - 26 мм, а для диска, содержащего по ГОСТУ 15 мкг эритромицина - 20 мм.Образование указанных размеров зон задержки вокруг диагностических дисков с избранным антибиотиком свидетельствует а соответствии стандарту как собственно10 20 25 30 35 40 50 55 используемый диагностический диск не содержит обусловленное ГОСТом количество антибиотика, либо микробная нагрузка тест-культуры в газоне не соответствует оттитрованному стандарту, либо не стандар- тен состав применяемого питательного агара, В этом случае исследование повторяют до получения стандартных результатов.При выявлении стандартных размеров зон торможения вокруг диска с антибиотиком приступают к определению размеров аналогичных зон у исследуемых проб тканей.Наличие вокруг дисков с пробами тканей зон задержки роста тест-культуры свидетельствует о возникновении в тканях пораженного сигмента повышенной обеззараживающей активности, А если таких зон нет,то это указывает на отсутствие формирования в тканях повышенного обезэараживающего эффекта,Далее измеряют размеры зон торможения роста тест-культуры вокруг дисков с исследуемыми пробами тканей, сопоставляют их с размерами эоны вокруг диагностического диска с антибиотиком и выракают обеззараживающую активность в показателях эквивалента избранного антибиотика. А уровень обеззараживающей активности диагностируют по отношению этих показателей к диапазону средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации (МПК) данного антибиотика, При этом. исходят из того, что диапазоны таких средней терапевтических МПК составляют для мономицина 15-20 мкг/мл, для эритромицина при парэнтеральном введении - 9-12 мкг/мл, для пенициллина - 7-10 ЕД/мл и т,д,Следовательно, если исследуемая проба тканей образовала зону торможения роста тест-культуры, например, диаметром 18 мм, то ее сопоставление с зоной задержки роста в 22 мм, образовавшейся в этом же исследовании вокруг диагностического диска содержащего 30 мкг мономицина, позволяет определить эквивалент ее обеззараживающей активности в 24,6 мкг/мл мономицина,Если же эквивалент обеззараживающей активности определяют по отношению антибиотика эритромицина, то проба ткани образовавшая зону торможения в 18 мм, при размерах зоны торможения роста в 20 мм вокруг диагностического диска содержащего 15 мкг эритромицина, будет иметь эквивалент обеззараживающей активности в 13,5 мкг/мл эритромицина,Если же в качестве диагностического диска использовали диск содержащий 16 ЕД пенициллина, то при размерах зоны торможения роста с пробой ткани в 18 мм, .эквивалент ее обеззараживающей активности в исследуемой пробе будет составлять11,1 ЕД/мл пенициллина. Далее, исходя издиапазона средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации используемого антибиотика - диагностируютуровень обезэараживающей активноститканей.При этом, давая оценку показателю выявленного эквивалента антибиЬтика дляданной пробы ткани, одновременно, судят овысоком, среднем или низком уровнях обеззараживающей активности по соответствиюэтого уровня диапазону среднего МПК,Так, например, наличие зоны задержкироста тест-культуры вокруг диагностического диска содержащего 30 мкг мономицинадиаметром в 22 мм свидетельствует о стандартности постановки исследования. Сопоставляя эти величины с размерами зоныторможения роста тест-культуры вокруг диска с исследуемой пробой в 17 мм, делаютвывод, что в тканях исследуемой пробы эквивалент обеззаракивающей активностиравен 23,8 мкг/мл мономицина. А посколькусредняя МПК для этого антибиотика составляет 15-20 мкг, делают вывод о том, что в.тканях сформировался высокий уровеньобеззараживающей активности.Если бы зоны задержки роста тест-культуры в этом же анализе у исследуемых проббыли бы, например, диаметрами в 9 и 12 мм,то это соответствовало бы эквиваленту концентрации мономицина, соответственно, в12,3 и 16,4 мкг/мл, что позволило бы сделатьвывод о низком и среднем уровнях обеззараживающей активности в исследуемых тканях,Полученные данные служат объективным критерием для диагностики течения остеосинтеза. И при получении средних иливысоких уровней эквивалента обеззараживающей активности тканей диагностируютблагополучное течение, а при отсутствииили низком уровнях эквивалента - неблагополучное течение остеосинтеза,Диагностику течения остеосинтеза, наоснове предлагаемого способа выполняют вдинамике в течение всего периода леченияметодом чрезкостного остеосинтеза с интервалами в 3-4 недели, а при необходимости выполняют чаще, При этом, в связи смедленным появлением и также медленнымзатуханием процесса повышения обеззараживающей активности в тканях поврежденного сегмента в системе"аппарат+конечность" первое исследование выполняют не ранее чем через 48 часовс момента начала действия факторов напряжения растяжения или напряжения сжатия и не позднее 48 ч после прекращения действия указанных факторов,Больной Ц. 30 лет, архивная карта 16018, поступил в клинику ВКНЦ "ВТО" с диагнозом: Неправильно сросшийся перелом костей голени, хронический остеомиелит, свищевая форма. Была выполнена операция: "Секвестрнекрэктомия участка большеберцовой кости, остеотомия большеберцовой и малоберцовой кости, остеосинтез аппаратом Илизарова". Тактика остеосинтеза состояла в проведении билокального дистракционно-компресссионного остеосинтеэа. В результате лечения был замещен костный дефект, достигнуто хорошее сращение отломков, купирован остеомиелит, выправлена ось конечности. На 16 день после операции - в аппарате выполнялся режим дистракции,Проведено лабораторное исследование по предлагаемому способу. На стандартный газон тест-культуры поместили диагностический диск, содержащий 30 мкг мономицина и диски пропитанные тканевой жидкостью из тканей соответствующих верхней и нижней опорным базам аппарата, Посевы термостатировали в течение 48 часов. В результате исследования выявлено образование стандартной зоны торможения роста тест-культуры вокруг диагностического диска с мономицином диаметром 22 мм, Проба тканевой жидкости из спицевого канала верхнего кольца образовала зону торможения роста диаметром 17 мм, а иэ нижнего кольца - диаметром 15 мм, эквиваленты которых по мономицину составляют 23,3 и 20,4 мкг/мл, Так как диапазон средней терапевтической концентрации маном и ци н а составляет 15-20 м кг/мл, то в исследуемых пробах тканевой жидкости можно определить, соответственно, высокий и средний уровни обеззараживающей активности тканей в пораженном сегменте и на основании этого диагностировать благополучное течение остеосинтеза.Клинические проявления на данном этапе определялись следующим образом: повязки сухие. болезненность отсутствует, ходитс нагрузкой на конечность с дополнительной опорой; рентгенологически течение остеосинтеза в норме; анализ крови" Эр, - 4,62,10; Нв - 149 г/л; Цв.п. - 0,9; лейкоциты - 10,7.109; Э - 1; пал, - 1; сегм. - 54; лимф. - 39; мон, - 5; СОЭ - 15 мм/ч,Обследование на 54-й день после операции - в аппарате продолжается выполнение этапа дистракции, Забраны две пробы тканевой жидкости из спицевых каналов в верхнем и нижнем кольцах аппарат, которые вместе с диагностическим диском с 30мкг мономицина помещены на стандартныймикробный газон тест-культуры и термоста 5 тированы в течение 48 ч, В результате быливыявлены следующие зоны задержки ростана газоне тест-культуры; вокруг диагностического диска с 30 мкг мономицина - 22 ммвокруг диска с пробой тканевой жидкости из10 верхнего кольца 16 мм; вокруг диска с пробой тканевой жидкости из нижнего кольца 8мм,Наличие зоны торможения роста стандартного размера в 22 мм вокруг диагности 15 ческого диска содержащего 30 мкгмономицина позволяет рассчитать его эквивалент обеззараживающей активности в исследуемых пробах тканевой жидкости,который составлял в проксимальном и дис 20 тальком участках поврежденного сегмента,соответственно, 21,8 и 10,9 мкг/мл, Сопоставление с диапазоном средней минимальной подавляющей концентрациеймономицина в 15-20 мкг/мл позволяет диаг 25 ностировать в исследуемых пробах высокийи низкий уровни обеззараживающей активности тканей. Клиническая картина характеризовалась следующими данными; повязкисухие, ран и свищей нет, температура в нор 30 ме, анализ крови: Эр. - 4,43 10; Нв - 130/л; Цв.п, - 0,85; лейкоциты - 11,0109; Э - 2;пал, - 2; сегм, -56; лимф. - 35, Мон. - 6; СОЭ- 18 мм/ч.Лабораторная диагностика снижения35 уровня до низкого эквивалента обеззараживающей активности тканей на уровне дистальной опоры аппарата указывала нанарушение здесь условий оптимального течения остеосинтеза о чем было сообщено40 лечащему врачу и сделано соответствующеезаключение в истории болезни, Однако,обосновываясь на внешне благополучнойкартине клинического течения остеосинтеза, ревизии систем аппарата лечащий врач45 не предпринял,В результате этого, через 6 дней (60-есутки после операции) после данного обследования у больного отметили появлениеследующих клинических симптомов; повы 50 шение температуры.от 37,5 до 37 З С в веочернее время, сильная болезненность вобластитканей дистальной опоры аппарата,появление серозно-геморрагического отделяемого из отверстий обоих спицевых кана 55 лов в дистальном кольце. Анализ крови; Эр.- 4,6010; Нв, - 144 /л; Цв,пок. - 0,9;9,лейкоциты - 11,5 10; Э - 1; пал; - 4; сегм. -54; лимф. - 28; Мон. - 4; СОЭ - 19 мм/час.При ревизии систем аппарата обнаруженопрореэывание спицами мягких тканей в ре10 ца - зоны торможения роста отсутствовалй. 15 20 25 30 Через 15 дней после перемонтажа аппа 40 зультате чего произошло нарушение стабильностии фиксации костных отломков.Выполнение в этот же день лабораторное исслвдованиепо предлагаемой методике установлено образование следующих диаметров зон торможения роста на газоне тест-культуры:вокруг диска содержащего 30 мкг мономицина - 22 мм,вокруг диска с пробойтканевой жидкости из тканей на уровне верхней опоры аппарата - 12 ммвокруг дисков с пробами тканевой жидкости из тканей среднего дистальногокольНа основании проведенных расчетов по предлагаемому способу уровни:обеззараживающей активности в эквиваленте антибиотика мономицина в тканях верхнего кольца составили 16,4 мкг/мл, а в нижней опорной базе - полностью отсутствует, что свидетельствует о явном нарушении благополучного течения остеосинтеза в дистальной опорной базе аппарата и явную тенденцию к нарушению в целом общего течения остеосинтеза на данном этапе лечения больного,На следующие сутки, в срочном порядке, больному был произведен перемонтаж аппарата, выполнена новыми спицами коррекция центрации концов отломков и траектории их.перемещения по оси сегмента,достигнута стабильная фиксация отломков вобеих опорных базах аппарата. рата - признаки воспаления тканей вокруг спиц были купированы Выполнено очередное лабораторное исследование при котором эквивалент обеззараживающей активности тканевой жидкости из проксимального спицевого канала по мономицину составлял 21,8 мкг/мл, а в нижнем кольце - 15 мкг/мл, что позволяло диагностировать высокий и средний ее уровни при которых течение остеосинтеза происходит без осложнений. Клиническая картина характеризовалась наличием сухих повязок вокруг отверстий спицевых каналов, нормальной . температурой, отсутствием болезненности; анализ крови: Эр. - 4,48.10; Нв - 140 /л; Цв.п, - 0,9: лейкоциты - 7,1 10; Э - 1; пал, - 1; сегм, - 64; димф. - 34; Мон. - 3; СОЭ - 17 мм/ч.В дальнейшем, до окончания срока выращивания костного регенерата в зоне костного дефекта, многократно диагностировали высокие и средние уровни обеззараживающей активности в обоих опорных базах аппарата, что успешно сочеталось с замещением дефекта и купирова 45 50 кием остеомиелитического процесса, при благополучном течении остеосинтеза,Предложенный способ обеспечивает возможность Оценки течения остеосинтеза на основе объективных показателей уровней обеззараживающей активности. тканей,Данная методйка позволяет прогнозировать клиническоетечение остеосинтеза.При этом следует иметь ввиду, что показатели обеззараживающей активности тканей вусловиях чрескостното остеосинтезапозволяютсудить охарактере его 1 ечения еще допоявления койкретных клиййческих проявлений: болевых ощущений, изменения температуры тела; показателей общего анализакрови, даннь 1 х локального статуса и рентге-.нографической картины;В силу этого, использование предло-"женной методики позволяет клинициступринимать оперативные меры по предупреждению возможных нежелательных осложнений или констатироватьправильность выбранной тактики остеосинтеза. Более того, количественные показатели уровней обеззараживающей активноститканей, определяемые по настоящей методике, позволяет сделать вывод о том илиином характере течения остеосинтеза ещедо получения данных свидетельствующихоб явном улучшении или ухудшении -путемсопоставления результатов ранее выпол-,ненных исследований и выявления на основании этого тенденции их изменения.Полученные данные свидетельствующие об неблагополучном течении остеосинтеза служат объективным обоснованием дляпринятия оперативных мер по предотвращению возможных осложнений.Данное положение представляется особенно актуальным если учесть, что в клини-ческой практике, до настоящего времени,процесстечения остеосинтеза, как правило,оценивается по клиническим показателям.Т.е. тогда, когда те или иные осложненияуже имеют место и, естественно, на их устранение необходимо затратить дополнительное время, что не только увеличиваетсроки лечения, но и может отрицательносказываться на его результаты,В тоже время, полученные с помощьюпредложенной. методики данные, свидетельствующие о благоприятном течении остеосинтеза не только объективноподтверждают правильность выбраннойтактики лечения, но и позволяют клиницисту активно воздействовать на лечебныйпроцесс, Зачастую объединять решения нескольких лечебных задач: купирование остеомиелитического процесса как такового,1781610 12 возмещение дефекта костной ткани, исправление деформации сегмента конечности, что, естественно, сказывается на сокращении сроков лечения.Полученные данные могут подвергаться математической обработке и построению на этой основе программ компьютерного контроля за течением лечебного процесса при чрескостном остеосинтезе. Составитель В.БрусиловскаяРедактор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор О.Густи Заказ 4271 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Ф ормул а изобретения Способ определения бактерицидной активности тканей, включающий зазор биоло. гической пробы на диск фильтровальной бумаги, размещение его на микробном газонетест-культурь 1, термостатирование и последующее определение зоны задержки роста тест-культуры вокруг диска с исследуемой пробой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности определения и расширения функциональных возможностей способа для оценки течения остеосинтеза, на микробном газоне дополнительно 5 размещаютконтрольный диск, содержащийстандартное количество антибиотика, ипосле получения соответствующей для данного антибиотика зоны задержки роста тест-культуры Определяют в опыте обеззэ раживающую активность тканей в эквиваленте избранного антибиотика, .сопоставляют ее с диапазоном средней терапевтической минимальной подавляющей койцентрации данного антибиотика и при 15 превышении или соответствии этому диапазону судят о высокой бактерицидной активности тканей при чрескостном остеосинтезе, а при снижении или отсутствии - о низкой,20