Способ получения лимонной кислоты

1 ц 695230 ОП И САН ИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) ПриоритетОпубликовано 23,06.82, Бюллетень23Дата опубликования описания 23.06.82 51) 1. Кл,С 12 Р 1 Государственный комите СССР о делам изобретени и открытий, финогенова Р, Я, Каркл В, Т, Лука и иологии мик завод биохи Латвийской Н, В.нь, И,(71) Заявители оорганиическихСР ститут биохимии и фи Экспериментальный АН54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ биолок споИзобретение относится к микрогической промышленности, а именнособу получения лимонной кислоты.Лимонную кислоту получают в основном путем культивирования специально селек ционированных штаммов плесневых грибов на средах, содержащих углеводы (сахароза, меласса, крахмал и др.) в качестве основного источника углерода,Известен способ получения лимонной 1 О кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей вида СапдЫа 11 ро 1 у 11 са в условиях аэрации на питательной среде, содержащей нормальные парафины в качестве источника углерода, источник 15 азота, минеральные соли с последующим выделением целевого продукта из культу- ральной жидкости 11.Однако известный способ обеспечивает достаточно высокий выход лимонной кис лоты.Целью изобретения является повышение концентрации и выхода лимонной кислоты.Поставленная цель достигается тем, что из вида СапдЫа 11 ро 1 у 11 са используют 25 штамм СапдЫа 11 ро 1 у 11 са НММ, при этом культивирование ведут при конценттрации клеток продуцента 10 - 30 г/л по сухому веществу, рН 5,5 - 6,5 и концентрации кислорода равной 50 - 80% насыще- зо Характеристика штамма СапдЫа 11 ро 1 у 11 са НММ.Штамм СапйЫа 11 ро 1 у 11 са НММполучен путем обработки клеток СапдЫа 11 ро 1 у 11 са ИБФМ у(704) нитрозометилмочевиной и последующего отбора,Мутантный штамм хранится в Отделе биоэнергетики ИБФМ АН СССР.Штамм Сапйда 11 ро 1 у 11 са НММимеет следующую характеристику,Молодая культура на жидком и агаризованном сусле представлена округлыми, овальными и слегка удлиненными клетками размером 2,0 - 5,0 3,0 - 10,0 мк. Встречаются сильно удлиненные клетки размером 2,4 11,0 - 16,0 мк, а также цепочки из 3 - 4 клеток.При росте на жидком сусле при 25 С на восьмые сутки образуется тонкая пленка на поверхности среды и небольшой плотный осадок на дне пробирки. На 15 - 16 сутки пленка становится более толстой, осадок увеличивается.Колонии на сусло-агаре (10 суток) беловато-кремовые, гладкие, матовые, выпуклые, центр колонии несколько приподнят, края ровные. Гигантская колония кремового цвета по краям желтовато-зеленая, слегка морщинистая, плоская, центр приподнятый, края слабо лопастные,10 15 40 3,0 0,7 0,5 0,4 1,0 0,1 2,0 мл 3Рост по штриху плоский, гладкий, матовый, кремового цвета, края ровные.Культура на стекле на картофельномагаре: псевдомицелий слабо развит, Строгий аэроб. Сахара не сбраживает, Ассимилирует глюкозу, этанол, ацетат, глицерин.Слабый рост на галактозе.Не ассимилирует лактозу, мальтозу,сахарозу, рафинозу, арабинозу, ксилозу,крахмал.Использует (КН 4) г 504 и МН 4 С 1 в качестве источника азота.На нитратах не растет.Молоко пептонизирует полностью.Оптимальная температура роста 26 -30 С, максимальная - 33 С,Хранится на агаризованной среде Ридерс парафином и в ампулах в диофилизированном состоянии,Описанный штамм Сапйда Иро 1 уЫсаНММхарактеризуется способностьюпри росте на средах с н-алканами продуцировать преимущественно одну лимоннуюкислоту, изолимонная кислота практическине накапливается.Для оценки стабильности мутанта Сапс 1 Ыа Иро 1 уЫса НММего пересевают втечение 4 месяцев на свежую среду с парафином (культивирование в колбах накачалке), в общей сложности проведено40 последовательных пассажей. За времячастых пересевов культура не только неутрачивает способность продуцироватьпреимущественно цитрат, но соотношениецитрат: изоцитрат в среде еще более сдвигается в сторону преимущественного накоплейия цитрата (от 8: 1 до 12: 1) .Хранение мутантного штамма в течение4 лет на агаризованной среде с парафиномтакже не ухудшает свойств этой культуры,Мутантный штамм Сапййа Иро 1 у 11 саНММпри всех испытаниях обнаруживает стабильность основного практическиважного свойства - преимущественныйсинтез цитрата на средах с н-алканами,Пример 1, Дрожжи Сапйс 1 а Иро 1 у 11 саНММподдерживают на агаризованнойминеральной среде Ридер с нормальнымипарафинами (Сг - С), имеющей следующий состав, г/л:Нормальные парафины 10,0(КН 4) г 04МдЯ 04 7 НгОИаС 1Са (КОз) гКН,Р 04К,НР 04Дрожжевой автолизатНабор микроэлементовпо Буркгольдеру фАгар-агар 25,0 ф Набор микроэлементов по Буркгольдерувключает следующие компоненты (мг/л 20 25 30 35 45 5055 б 0 б 5 4среды): КЗ 0,1; В 0,01; Мп" 0,01;7 п+ 0,01; Сцг+ 0,01; Мо" 0,01; 1"ег 0,05,Дрожжи выращивают на косяке в течение 3 суток при 28 - 30 С, Суспензию клеток с агаризованной среды переносят вколбы объемом 750 мл, содержащие 50 млпосевной среды.Состав посевной среды, г/л;Нормальные парафины 48,0(МН 4) г 504 3,0Мд 504 7 Н,О 0,7ХаС 1 0,5Са (КОз) г 0,4К 1 1 гР 04 1,0К,НР 04 0,1Дрожжевой автолизат 4,0 млНабор микроэлементовпо Буркгольдеру,Через 48 ч инкубации на качалке полученную посевную культуру переносят вновую партию колб с посевной средой,объем инокулума 6% от объема среды.Вторую партию колб также помещаютна качалку при 28 - 30 С; во время культивирования; продолжавшегося 50 ч, рНсреды поддеряивают на уровне 6,0 - 6,5введением стерильного 10%-ного раствораКаОН.500 мл выросшей культуры переносятв ферментационную среду. Объем среды3,5 л,Состав ферментационной среды, г:Нормальные парафины 600(кн 4) ьо 4 20,0Мд 04 /НгО 2,8 гК аС 1 1,5Са (ХОз) г 1,6КН,Р 04 4,0К,НР 04 0,4Дрожжевой автолизат 8,0 млФерментацию проводят в ферметационном аппарате АНКУМобъемом 10 л.Процесс осуществляется при 29 - 30 С вусловиях интенсивного перемешивания иаэрации среды воздухом. Концентрациюкислорода в среде поддерживают 75 - 85/онасыщения.рН среды регулируют введением раствора МаОН на уровне 6,0 - 6,5.Максимальная концентрация клеток продуцента на третьи сутки ферментациидостигает 13 г/л.Через 144 ч культивирования достигаютконцентрации лимонной кислоты 217 г/л,одновременно в среде накапливается изолимонная кислота, ее концентрация 6 г/л.В аппарате общее содержание лимоннойкислоты безводной - 868 г или моногидрата 949,2 г, Ферментационный выход безводной лимонной кислоты по весу составляет145% и моногидрата 158% от внесенныхпарафинов.695230 10 15 Формула изобретения 5,0 1,4 0,5 0,8 2,0 0,2 4,0 Составитель М. ЛаринаТехред А, Камышникова Корректор О, Тюрина Редактор П. Горькова Заказ 764/б Изд. Мз 157 Тираж 505 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 5Пример 2. Посевной материал (10 о/о от объема среды), приготовленный аналогично примеру 1, размножают последовательно в ферментаторах емкостью 63 л и 400 л на среде следующего состава, г/л:Нормальные парафины 48(1 Н 4) гБ 04 6,0 МО, 7 Н,О 0,7 МаС 1 0,5 Са (КОз) г 0,4 КН,РО 4 1,0 К,НРО., 0,1 Дрожжевой автолизат 2,0 Набор микроэлементовпо Буркгольдеру,Концентрация клеток продуцента (посухому весу) достигает 30 г/л. Длительность процесса в каждом ферментаторе 2048 ч при температуре 28 - 30 С и рН 5,0 - 5,5,Основную ферментацию осуществляютв фермецтаторе емкостью 3000 л. Коэффициент заполнения аппарата 0,6. Посевнойматериал вносят в ферментатор в количестве 10% от объема среды,Состав ферментационной среды, г/л:Нормальные парафины 100(КН 4) гЯОМд 304 7 НгОКаС 1Са (КОз) гКН,РО 4КгНРО35Дрожжевой автолизатНабор микроэлементовпо Буркгольдеру.Ферментацию проводят при 28 - 30 С, 40рН среды поддерживают на уровне 5,6 - 6,0введением стерильного 20/о-ного раствораКаОН.Концентрацию кислорода в ферментационцой среде поддерживали первые сутки 4550 - 60%, вторые-четвертые сутки увеличивают до 80% и на пятые сутки снижаютдо 50%. В течение процесса фермецтации на вторыс-четцсртыс с тки с промежутком в 24 ч добавляют в ферментационную среду нормальные парафины, каждая порция составляла 2% от объема среды,Максимальная концентрация клеток продуцецта на вторые-третьи сутки ферментации 20 г/л.Продолжительность основной ферментации 120 ч,К концу ферментации общее содержание лимонной кислоты в аппарате 368 кг. Ферментациопцый выход безводной кислоты составляет 128% по весу от внесенных парафинов.Использование предложенного способа позволяет наладить производство лимонной кислоты из непищевого сырья - нормальных парафинов - с более высоким выходом, чем по известным способам, Себестоимость лимонной кислоты, полученной по данному способу, значительно ниже себестоимости этой кислоты, полученной из мел ассы,Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей вида Сапйс 1 а 11 ро 1 у 11 са в условиях аэрации на питательной среде, содержащей нормальные парафины в качестве источника углерода, источник азота, минеральные соли с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отл и ч а ю щи й ся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, из вида Сапйда 11 ро 1 у 1 са используют штамм Сапйда 11 ро 1 у 11 са НММ, при этом культивирование ведут при концентрации клеток продуцецта 10 - 30% по сухому веществу, рН 5,5 - 6,5 и концентрации кислорода, равной 50 - 80% насыщения. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент СССР Мв 448652, кл, С 12 Р1/04, опублик, 1974.