Способ определения функциональной полноценности фибриногена

(51) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ институт х органов Будякова,Т 1 оаЬо2 - 49,(54) СПОСОБНАЛ Ь НОЙ,ПОЛГЕНА(57) Изобретенименно к гемаопределения фсти фибриногеется повышенСпособ осущес ПРЕДЕ НОЦЕН НИЯ ФУНКЦИООСТИ ФИБРИНОие относит ологии, иункционал а. Целью е специфтвляют по ся к медицине, а касается способа ьной полноценно- изобретения являичности способа, средством забора ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56)рпзЬ ВЮогоазК КОайез Наетогзт, 1968, В 2, рр Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и касается способов диагностики нарушений свертывающей системы крови в клинике и эксперименте.Известен способ определения функциональной полноценности фибриногена методом количественного его определения в сгустке плазмы, путем инкубэции стабилизированной плазмы при добавлении СаС 2 и тромбина (Рутберг Р.АЛабораторное дело, 1961, М 5, с.6), Однако, этот способ недостаточно специфичен, т.к. при наличии эндоили экзогенного гепарина в плазме, а также при патологических состояниях, связанных с развитием ДВС-синдрома (например, активация фибринолиза) дает искаженные результаты, либо вообще не дает фиксированного результата,крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму смеси 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 30-ного раствора хлористого кальция, в контрольную плазму ту же смесь без протаминсульфата, взвешивания эбразовавшегося сгустка и в случае увеличения его веса по сравнению с контролем делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности в случае уменьшения его веса - о частичном нарушении, а в случае образования хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена. Положительный эффект заключается в возможности количественного измерения, в то время кэк в прототипе проводилась качественная оценка. 3 табл,Известен также способ определения гиперфибриногенолитической активности крови, путем количествеййого определения фибриногена в цитратной плазме в присутствии ингибитора фибринолиза - раствора О ЭАКК= который при сравнении с контрольной пробой дает возможность определить ф. степень диссоциации фибриногена в усло- Я виях резкой активации фибриногенолиза (Л (А.С, М 1469468, 1988), Однако, указанный способ не дает возможности количественного определения функциональной полноценности фибриногена в условиях гепаринизации плазмы крови различной этиологии, что является непременным условием проведения экспериментов по имплантации искусственного сердца с применением аппарата искусственного кровообращения, а также при лечении больных1767425с различной патологией ней, находящихся в кли- зом: в контрольную и об 0 5ническом состоянии.про ирку к , мл цитИзратной плазмы добавляют 0,1 мл 30 -ногоз известных, наиболее близким явля- хлорист О,ется способ определения функциональной бхло истого кальция и,1 мл раство а тина, активностью 10 с. В опытн ю и обр р ромполноценности фибриногена, путем опре т, - , мг протакои же смеси добавляют 0,1 - 0,6 мг проделения фибриногена В с использованием таминсульф (протаминсульфатного теста Орпзб В., иминсуль ата (количество о ав( рпз., протаминсульфата зависит от активностоголягогпЬоз. Оэрез, Наегпоггй., гепа инигепэрина в плазме крови и колеблется от 0,1Пинидо 0,6 мг на мл, из расчета 0,1 мг протаминринцип: Появление в плазме сгустка 10 сульфатана 1 ЕДактивностигепа ина.при добавлении к ней протаминсульфата бактивности гепарина). Обеговорит о наличии в этой плазмпро ирки ставят на во ян ю бме неполя - 10 мин для свертывания фиб ин гризующихся (заблокированных) фиби рин- Получаемые с стки фиб ир фибриногена,мономерных комплексов, Возм жозможность циональны исходному количеств и иобразования этих комплексов после забора 15 гена, Сле ве тву фибринок овипа гена, ледовательно, для полученияр редупреждэется добавлением к цит- количества фибрату натрия ЭАКК.ва фи риногена и выражения его вг/л получаемые сгустки фибрина быстро выпосо принят нами в качестве прото- сушиваю ф ртипа, Однако этот способ недостаточно спевают на ильтровальной бваю р умаге, взвешивают на торсионных весах. Вес сгусткацифичен, т,к, позволяет лишь качественно 20 умножаетс "2", ф цопределить наличие деградированного делят на 100. П ово ятс автся на, на коэффициент 22 2,2 ифибриногена при развитии ДВС-синд ома т- в-синдрома трации фибриногена в контрольной и всреднеи степени тяжести, крайние проявле- опытно бния (легкие и тяжелые) этого синдрома, в сульфата,пытной про е с добавлением и отб р аминчастности обратимые и необратимые нару П и ншения ф нкри нормальной функциональной поля функциональной полноценности ноценности ф бфибриногенэ тест не улавливает, э также не ф би риногена кон ент аи риногена в конт ольной иц р цииработает в условиях гепаринизации. бр опытнои проах одинаковы. При увеличении концент аЦелью изобретения является повыше- ции ф брание специфичности способа. 3и риногена в опытопытной пробе с0 добавлением протаминсульфата от 0Поставленная цельдостигаетсятем,что 7,1 г/лделаетвыво очдоб ба оре осуществ- блокаде фибриногена гепарином, т,е. обляют, /-ным раствором цитрата натрия, ратимом нарушении его ф нк и нв опытную пробу с протаминсульфаь атом полноценности. При меньшениидобавляют смесь тромбина и СаС 2, а в 35 т э ии и2, э в трэции фибриногенэ в опытной пробе сольную - ту же смесь без протамин- протаминс ль атомуИ "И г/лдо по Рэвление функциональной нению с контролем - о чэСтичном наполноценности фибриногена осуществляют фнарушепутем взвешивания сгустка фибриногена и ф бнии ункциональной полно енн тц остив случае увеличения его веса по сравнению 40 ф бфи риногена, а при рассыпании сг усткас контролем делают заключение об об атифи риногена на хлопья сф, оответственно, очение о о рати- необратимом нарушении его ф нк ионал -.мом нарушении его функциональной полно- нои полноценности,ценности, связанной с гепаринизацией, в Ослучае уменьшения веса сгустка - о ч - 20существление способа з- частич- мин от момента взятия к ови,а занимаетном его нарушении, а в случае полного р - 45пада его на хлопья - о полном нарас- предлагаемому способ и спу особу-протоего функциональнорушении типу прове ено 3 ий полноценности, эксперимента, Сравнительная ир р д 33 исследования в условияхСпособ осуществляется следующи бравнительная диагностичеразом: кровь у экспериментальногоим о - ская информативность и п огр гностическаятного или больного забирают из вены, не 50 нию со,г живо- ценность предлагаемого сп особа по сравнесдавливая мягких тканей, силиконирован- выше, Способ-и ототип неиз вены, не 0 нию со, способом-прототипом значительноной иглой в силиконированную и обие, посо -прототип не позволяет дать8/к в -ный раствор цитрата натрия фибриногена вслучаяхк айнихнав соотношении 9:1, Центрифугируют при а также при условии гепа иниз1500 об/мин. в течение 7 мин для получения 55 тного,плазмы, Плазму отсасывают и через 10 мин Пот момента взятия крови из сосудистогор и м е р 1. Теленок, 3-х ме сячногорусла проводят определение количествозраста, весом 86 кг. Экспе имр мент по импфибриногена в двух параллельных пробтва лантации .искусственного се рдца с испольфибриноген определяют следующим обра- к овообо ах, зованием аппарата иск су ственногом о ра- кровообращения. Исследования проводи55 лись на наркотизированном животном каждые 30 мин на фоне работы аппарата искусственного кровообращения, и через каждый час после отключения аппарата и нейтрализации гепарина протаминсульфатом. Способ осуществляется путем забора крови из вены, не сдавливая мягких тканей, силиконированной иглой в пластмассовую пробирку: 4,5 мл крови и 0,5 мл 3,8 о -ного цитрата натрия. Точно фиксируется время взятия крови: тот час пробирку центрифугируютпри 1500 об/мин в течение 7 мин для получения плазмы. Затем в две пробирки помещают по 0,5 мл плазмы, в контрольную пробу добавляют 0,1 мл 3-ного раствора хлористого кальция и 0,1 мл тромбина 10 с активности; в опытную пробу - ту же смесь и 0,01 мл 1%-ного раствора протаминсульфата (0,1 мг), Обе пробирки ставят в водяную баню при 37 С на 5 - 10 мин. для свертывания фибриногена. После визуальной оценки полученные сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка умножают на "2", на коэффициент 22,2, согласно способу Рутберг, и делят на 100, Проводят сравнительную оценку концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах, Параллельно проводится определение растворимых фибринмономеров по способу-прототипу. Дополнительноо проводят определение спонтанного времени свертывания крови, определение активированного частичноготромбопластинового времени (АЧТВ) длявыявления активности гепарина. При осуществлении заявляемого способа на фоне гепаринизации использовались различные концентрациипротаминсульфата от 0,1 до0,6 мг на 1 мл плазмы, в зависимости от активности гепарина из расчета 0,1 мг протаминсульфата на 1 ЕД активности гепарина в 1 мл плазмы.Результаты эксперимента представлены в табл,1,Заключение: Таким образом, использование заявляемого способа позволило на протяжении всего эксперимента проследить за количественным содержанием,сохранностыб функциональной полноценности фибриногена на фоне гепаринизации, а также за адекватной нейтрализацией гепарина протаминсупьфатом,П р и м е р 2, Теленок 3,5 месяцев, весом 83 кг, Клинически здоров. Эксперимент по имплантации искусственного желудочка сердца с использованием АИКа, Исследования в процессе эксперимента проводились на тех же этапах и с использованием способа-прототипа и заявляемого способа по ме 5 1015 20 253035404550 тодйке, описайной впредыдущем примере, Результаты исследований приведены в табл,2.Животное погибло через 2 ч после отключения АИКа и нейтрализации гепарина протаминсульфатом от кровотечения, связанного с резким нарушением свертывающей системы крови. Эти нарушения не представлялось возможным скорригировать.В этом случае использование заявляемого способа дало возможность выявить нарушения функциональной полноценности фибриногена у интактного животного, а именно резко выраженную диссоциацию фибриногена с 6,6 г/л до 2,2 г/л при добавлении протаминсульфата. Никакой клинически выраженной патологии у теленка не выявилось,В процессе эксперимента проявилось полное нарушение функциональной полноценности фибриногена, которое выявилось заявляемым способом при добавлении протаминсульфата "ин витро", а затем было спровоцировано "ин витра" при введении протаминсульфата для нейтрализации гепарина в организме теленка послеотключенйя аппарата искусственного кровообращения.При проведении исследований способом-прототипом были получены отрицательные результаты.Заключение: Таким образом, заявляемый способ может служить прогностическим тестом при серьезных ойератйвньгх вмешательствах, в частнбсТи, при операциях по трансплантации сердца и имплантации искусственного сердца, которые требуют использования аппаратов искусственного кровообращения, гепаринизации с последующей нейтрализацией протаминсульфатом,Нарушения функциональной полноценности фибриногена, выявленные по заявляемому способу следует использовать как прогностический тест при отборе животных на эксперименты, включающие использование аппарата искусственного кровообращения."П р и м е р 3, Предлагаемый способ определения функциональной полноценности фибриногена был использован -акже в клинике у больных реанимационного профиля.Больная Е 37 лет, история болезни Ь. 3378, поступила в реанимационное отделение с диагнозом сахарный диабет типа, Гиперосмолярный некротический гипергликемический синдром, сепсис,Состояние больной крайне тяжелое, требующее интенсивной терапии. Для опре1767425 5 10 15 20 25 30 35 40 Таблица 1 АЧТВ (се к.) Кол ичество добавляемого протаминсульфата(мг) Фиб иноген Этапы исследований49,0 0 На фоне наркоза Подключение АИКа30 мин работы АИКа 4,0 4,0 0,1 130,0 0,3 Не свернется 1 о же 3,1 0 135,0 0,3 0 3,1 деления функциональной полноценности фибриногена плазмы крови у больной не реже одного раза в сутки проводили исследование плазмы крови в соответствии с вышеописанным способом, параллельно - по способу-прототипу. Наиболее информативные показатели в данном клиническом примере выявлены на 3, 10, 15 и 20 сутки наблюдений,Сравнение результатов, полученных при использовании описываемого способа и способа-прототипа, представлены в табл;3.Определение функциональной полноценности фибриногена по предложенному способу соответствовало клинической картине заболевания. Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) соответствовало крайне тяжелому состоянию больной, частичное нарушение функциональной полноценности фибриногена (10 сутки) и/или выявление фибриногена, заблокированного гепарином (15 сутки), демонстрируют тенденцию к восстановлению функциональной полноценности фибриногена, как прогностически полоЖительный признак в течении заболевания. При восстановлении функциональной полноценности фибриногена (20 сутки) состояние больной оценивалось как средней степени тяжести при отсутствии рефрактерности к проводимой корригирующей терапии,Определение комплексов растворимых фибрин-мономеров по способу-прототипу в случае грубых нарушений функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) дало отрицательный результат, Аналогичная картина наблюдалась на фоне гепаринизации больной.Заключение; Таким образом, предлагаемыйспособ позволил выявить функциональную полноценность фибриногена в условиях ее грубых нарушений, а также в случае проведения гепаринизации у больной. Повышение специфичностиопределения функциональной полноценности фибриногена с помощью предлагаемого способа позволилО подобрать адекватйую корргирующую терапию и ойределить прогноз заболевания как перспективный;Использование предлагаемого способа определения функциональной полноценности фибриногена позволяет оптимизировать условия эксперимента, проводимого с использованием искусственного кровообращения, а в условиях клинического применения выявить наличие ДВС-синдрома на ранних стадиях его развития, провести адекватную коррекцию, которая позволит предотвратить грубую полиорганную недостаточность и сократить время пребывания больного в реанимационном отделении,Формула изобретения Способ определения функциональной полноценности фибриногена путем взятия крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму протаминсульфата, инкубации и регистрации образовавшегося сгустка, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности, в плазму добавляют смесь 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 30 Д-ного раствора хлористого кальция, в контрольную - ту же смесь без протаминсульфата, после инкубации взвешивают образовавшийся сгусток и в случае увеличения его веса по сравнению с кОнтрольной пробой делают заключение об обратимом нарушении его функциональнойп 6 лноценности, в случае уменьшении 6 го веса -"о частичйом нарушении,ав случае образования хлопьев - о полном нарушенйй функциональной полноценности фибриногена,фиб иноген Время свертывания крови, мин опытная проба, г/лконтрольная проба, г/л ЕД) 127,0 2,5 0,3 3,1 0 1 ч работы АИКа1,5 ч работы АИКаАИК отключен,введенП,С, длянейтрализации гепарина,Через 1 чпослеоткл.АИКаЧерез 2 чпослеоткл,АИКа Не свернется То же 0,3 3,0 0 142 3,5 0,75 73,4 0,1 1,3 93,9 0,8 0,1 4,0 3,0 30 65,4 0,1 4,0 4,0 20 0 АКИ - аппарат искуственного кровообращения;П,С. - протаминсульфат.По способу - прототипу результаты всех параллельных исследований были отрицательными. Таблица 2 Этапы исследований Время свер"тывания кро"ви, мин АЧТВ, с Фибриноген Количест" во добавляемогоП.Смг Активностьгепаринав ЕД,конт опытнаяроль, проба,проба 49,9 0130,0 2,9180,0 3,8298,0 9,0500,0 6,0187,0 3,8 660 12 2,2 1 На Фоне наркоза 2 Подключение АИКа 0,1 0,3 0,4 Не свернетсяТо же ХлопьяТо жет3 30 мин работы АИКа4 1 ч работы АИКа и 0,9 0,6 0,4 и 1,5 ч работы АИКа и и и Отключение от АИКа,введение, П.С,0,6 и и Через 1 ч после отключения АИКа Не определяется 8 Через 2 ч после отключения АИКа То же 0,4 и1757425 Таблица 3 Определение фибриногена позаявляемому способу в г/л Определение фибриногена В Суткинаблюдения резуль- заключениетат контр. опыт. заключениепроба проба 6,2 хлопья Отсутствие комплек"сов растворимыхфибрин-мономеров Резкое нарушение функциональной пол" ноценности фибрино гена, требуется корригирующая терапия 4,0 2,2 10 Выявляется наличиерастворимых комплексов фибрин-мономеров Частичное нарушениефункциональной полно"ценности фибриногена,необходимо продолжатьспециальную корригиру.ющую терапию. 178 35 Выявляется фибриноген, частично заблокированный гепариномгепаринотерапия) Отсутствие комплексоврастворимых фибринмономеров Отсутствие комплексоврастворимых Фибринмономеров 44 4,4 функциональная полноценность фибриногена восстановлена 20 Составитель Т.ТарановаТехред М.Моргентал Корректор С.Пекарь Редактор С.Кулакова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 3545 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5