Способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплантата

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 1,740236 Сфкзз СоветскихСоциалистическихРеспублик(088,8) Дата опубликования описания 1 8,06,80(72) Авторы изобретения Р, Л, Розенталь, Э. Л. Букатова, В, В, Соболев и Г. Р, Эйдеман Рижский медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОЛНОЦЕ ННОС:ГИ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА1Изобретение относится к области медицины и касается прогнозирования результатов трансплантации органов.Известен способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплантата путем определения фермента в перфузате 11. Однако известный способ не позволяет определить полноценность аллотран-.тосплантатта до его пересадки.Целью изобретения является определенйв полноценности вллотрансплайтата дбего пересадки,Эта цель достигается тем, что исследуют активность глицинамидинотрансферазы в первых 9,5-10,5 мп перфузата ипри активности фермента 0,1570,151МЕ трансплантат признают полноценным.Для осуществления способа проиэводят определение активности следующихферментов; лактатдегидрогеназы (ЛДГ),аспартатаминетрансфераэы (АСТ), глицин-амидинотрансферазы ( ГАТ),Обычными методами активность ферментов в первых 10 мл промывного раствора, получаемых непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии при отмывании донорской почки или вообще не выявляется или реакция идет не линейно, С целью концентрирования ферментов в укаэанные 10 мл промывного раствора добавляют сефадекс Г1 г на 10 мл. В этих условиях активность ферментов также не выявляется или реакция идет не линейно. Поэтому и проводят различные модификации, к промывочному раствору добавляют следующие реактивы в растворах цистеин в различных концентрациях (0,01 М; 0,05 М;0,1 М); окисленный глутатион (0,01 М;0,05 М; 0,1 М); 2-меркаптоэтанол (0,01%; 0,05%; 0,1%); трилон Б (0,01 М; 0,05 М; 0,1 М).Активность ферментов определяют при значениях рН 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,7;8; 8,0, При определении активности ЛДГ используют различные буферы;0238 25 74 триЬ-буфер, натрий-натриевый фосфатный и калийнатриевый фосфатный буферы, а также реакцию проводят при температу- ре 25, 32 и 37 С, При определении активности ГАТ дпя выявления образовавшихся микроколичеств аргинина применяют концентрации красителя 0,01%; 0,02%;0,03%; растворы 8-гидроксихинолина и 0,1%, 0,2%, 0,3% растворы гипобромита.Оптимальными являются следующие варианты; для ЛДГ необходимо.концентрирование промывного раствора сефадексом Г, использование калий-натриевого фосфатного буфера с рН 7,4 прио-32 С. Для АСТ - концентрирование , сефадексом Г, использование трилона Б, Для выявления активности ГАТ необходимо проводить инкубацию с буферно-субстратной смесью, содержащей 0,05% раствор 2-меркаптоэтанола и 0,05 М раствор трилона Б при рН 7,7.Добавление к.буферно субстратной смеси отдельно глутатиона, или цистеина, или типона Б или их сочетаний ( 5 вариантов) не позволяет выявить. активность ГАТ в тех же 10 мл промывного раство определяемого непосредственно после пе-.риода первичной тепловой ишемии при заборе донорской почки. Если в первых10 мл промывного раствора, вытекающего из почечной вены при первичной перфузии консервирующим раствором непосредственно сразу после периода первичнойтепловой ишемии, активность ГАТ быларавна 0 - О,ОЗМЕ (в среднем 0,014 10 0,012), аллотрансплантат у реципиентаначинал функционировать на операционномстоле; если активность в среднем составляла 0,15740061 МЕ, трансплантат функционировал на 14-21 день если же ак)15 живность ГАТ в среднем составляла;4,05.2,104 МЕ, то трансплантат вообще не функционировал.В таблице представлена активностьглицерин-амидинотрансферазы в перфу О вате непосредственно после периода пер,вичной тепловой ишемии в сопоставлениис функцией пересаженной почки у реципиента.+ЪЧ 2 М +51232158006О,ю + ОО Ь О + О,О 46.,РГ,МЕ 2. ст,МЕ 0 То есть акти позволяет выявл ценность органа периода первичйоИсследование амиаинотрансфер коррозию между ностью органа и х ферментов ненальную полно "венно послеишемии,5и глицин-,о определеннуюльной полноценью фермента,ость э ять функционепосредст й тепловой активностазы выявилфункциоиа тивн, При выявлени учшим соче танием являются раствор 8-гидроксйхиноли ый раствор гипобромита,Данные активности ферментов в промывном растворе, получаемом непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии при отмывании донорской почки, сопоставляют с функциональной активностью почки после ее пересад ки реципиенту. Активность лактатдегидро геназы и аспартатаминотрансферазы независимо от того, когда наступала функция почки у реципиентов сразу на операционном столе(,1), через 14-21 дней (11), или почка не функционировала ( 1 1 1 ), была приблизительно одинакова:,012 0,06 ,01 0,15 ,012 0,06 аблицы, есл ывном раств О, 010, 01 еципиента на е, если же 0 061 МЕна 14-21 и активоре не пре Как видно изность ГАТ в промвышала в среднемфункция почки уоперационном столГАТ была 0,157у реципиента был 2 МЕ,ступала нактивностьто функциядень, если74023же активность была 4,05+2,104 МЕ, топочка не функционирована вообще, Такимобразом,. при активности ГАТ в промывномрастворе не превышающей 0,3 МЕ, трансплантат можно считать функциональнополноценным,П р и м е р . При первичной перфузии во время забора почки у донора непосредственно после периода первичнойтепловой ишемии из почечной вены собирают вытекающую жидкость в количестве 10 мл, прибавляют 1 г сефадексаГи центрифугируют на рефрижератороной центрифуге при 1400 д и 4 С в течение ЗО мин. 5Надосадочную жидкость отсасываюти вносят по 0,2 мл в 2 пробирки: опыти контроль. В контроль для осаждениябелков добавляют 0,1 мл 30%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Затем в 20обе пробирки приливают по 0,7 мл буферно-:субстратной смеси, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,7(содержащей растворы 0,007 М орнитина,0,007 М канаванина 0,05% 2-меркаптоэтанола 0,05 М трипона Б),Обе пробирки инкубируют в течение1 ч при 37 С в термостате. Для осаждения белков в опытные пробирки прибавляют 0,1 мл 30%-ного раствора трихлорук-ЗОсусной кислоты.Все пробирки центрифугируют при1400 д в течение 15 мин. Затем отсасывают 0,5 мл насадочной жидкости и 6помещают в другие пробирки, прибавляют по 2,5 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,03%-ного 8 гидроксихинолина и 1 мл 0,3% раствора гипобромита, смешивают и фотометрируют при длине волны 490 нм анализ против контроля на СФ6 или на ФЗКМ. Активность ГАТ выражают в международных единицах.При активности фермента в промывном растворе не превышающей 0,3 МЕ трансплантат считают функционально полноценным.Предлагаемый способ позволяет достаточно прогнозировать полноценность почечного амортрансплантата и избежать пересадки неполноценного органа.формула и з о б р е т е и и яСпособ определения функциональнойполноценности почечного аллотрансплан-,тата путем определения фермента в перфузате, отличающийся тем,что, с целью определения полнОценностиаллонтрансплантата до его пересадки,исследуют активность глицин-амидинотрансферазы в первых 9,5-10,5 мл перфузата и при активности фермента0,157 ф 0,151 МЕ трансплантат призна- лют полноценным,. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.0 г 01.Ь 1, 1975, 30, р.362-368, СостееиФ.ыь С, МалютинаРедактор Н, Потапова Техред М. Петко Корректор Ю, МакаренкоЗаказ 3072/4 Тираж 673Подписное ЦНИИПИ. Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектйая, 4