Способ размножения гречихи in viтrо

(5)5 А 01 Н 4/ ГОСУДАРСТВЕН.4ПО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГкнТ СССР КОМИТЕТИ ОТКРЫТИЯМ ТЕН А сельскому хоовано в селекразмножении едованиях по ий,раненобно ие высо- СТИ Кдл- ультивиНИЕ ИЗОБ СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Казанский институт биологии Казанского филиала АН СССР(56) )агпапе . пбцсе 6 дИегепта 1 оп о 1 Ьцсс аЬа 1 раптз 1 гогп ыЬсцтцгед сацвел и У 1 го. .арап . белетсз. 1974, ч, 49, М 3, р, 139.Суриков И.М Мазур В,А. Получение регенерантов из различных тканей гречихи в культуре и Утго - Генетические основы селекции и семеноводства гречихи, Кишинев, 1985. с. 98.(54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ГРЕЧИХИ М ЧТЙО(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений при массовом размножении ценных экземпляров, в исследованиях по физиологии, генетике растений, Целью изобретения является сохранение высокой регенерациониой способности каллусной ткани при длительном субкультивировании. В способе размножения гречихи и ч 1 го, включающем вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде Изобретение относится к зяйству и может быть исполь ции растений при массовом ценных экземпляров, в исс физиологии, генетике растенЦель изобретения - сох кой регенерационной спо лусной ткани при длительно ровании. до получения первичной каллусной ткани и последующую пересадку ее на питательную среду для индукции органогенеза и получения растений-регенерантов, в качестве эксплантатов вычленяют незрелые зародыши размером 0,5-З,О мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60 дней, при этом культивирование эксплантатов и субкультивирование каллусной ткани осуществляют на питательной среде Гамбурга В 5, содержащей мг/л; никотиновая кислота 0,1-0,5 и дополнительно бакто-агар 7000-8000; гидролизат казеина 1500-2000; ИУК 0,1-0.5; НУК 0,3-0,5, кинетин 0,2-0,4. При этом для субкультивирования отбирают первичную каллусную ткань, представленную плотными глобулярными образованиями белого, светло-желтого цветов или мягкими комочками серого или светло-коричневого цвета, включающими блестящие плотные структуры белого или желтого цвета. Изобретение позволяет сохранить высокую регенерационную способность каллусных культур в течение 18 мес, При этом выход регенерантов на 1 г каллусной ткани на культурной гречихе составляет 3,5 шта татарской гречихе 23,0 шт, 3 табл 1 ил. Поставленная цель достигается тем. что в способе размножения гречихи и У 1 го,. включающем вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде до получения первичной каллусной ткани и последующей пересадке ее на питательную среду для индукции органогенеза и получение растений-регенерантов, в качестве зксплантатов вычленяют незрелые зародыши10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 размером 0,5-3,0 мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60 дней, при этомкультивирование эксплантатов и субкультивирование каллусной ткани осуществляютна питательной среде Гамбурга В 5, мг/л:МаН 2 Р 04 150КЙОз 2500(ЙН 4)2 Р 04 134М 9 504 7 Н 20 250СаС 2 2 Н 20 150НЗВОЭ 3.0Мп 504Н 20 10,0СоС 26 Н 20 0,025СО 304Н 20 0,0252 п 504 7 Н 20 2,0Йа 2 М 04 2 Н 20 0,25КЗ 0.75Ге 304 7 Н 20 28,0Тиамин-НС 10,0Пиридоксин-НС 1,0Никотиновая кислота 1,0Мезоиноэит 1002,4-Д 2,0Сахароза 20 000для субкультивирования отбирают первичную каллусную ткань, представленнуюплотными глобулярными образованиямибелого, светло-желтого цвета или мягкимикомочками серого или светло-коричневогоцвета, включающими блестящие плотныеструктуры белого или желтого цвета.Способ осуществляют следующим образом,Плоды гречихи через 4-13 дней послеопыления обрабатывают 70-ным этиловым спиртом в течение 0,5-3 мин (в зависимости от возраста зародыша) и затем 3-10мин, в 0,1 ф,-ном растворе диацида с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой.Зародыш длиной 0,5-3 мм вычленяют васептических условиях препаровальнымииглами и помещают на каллусогенную среду. Инкубируют 40-80 сут в темноте при25+.2 С в чашках Петри. В течение этоговремени на эксплантатах формируется первичный каллус и возможен отбор различныхморфологических типов каллуса, посколькуранее 40 дней определенные морфотипыкаллусов еще не выявляются, а позже 10дней начинается некроз тканей и выход каллусов с высокой морфогенной способностью снижается (табл. 1),УИсследования показывают, что в культуре каллусных тканей гречихи существуеттесная связь между источником эксплантата (зародыш определенной длины, морфологией каллусных культур и способностью этих культур к регенерации.Каллусы культурной гречихи (фиг. 1) согласно их морфологическим и гистологическим характеристикам могут быть условно разделены на 4 основных типа (А - гетерогенный, В - глобулярный, С - рыхлый, Д - плотноглобулярный). Как видно из фиг. 1, гетерогенные и плотно-глобулярные культуры обладают наиболее высокой почкообраэующей активностью. Однако для гетерогенных каллусов культурной гречихи характерна морфологическая нестабильность: с увеличением времени культивирования прогрессирует распад культуры на новые морфологические типы и, как следствие, переход ее в разряд глобулярных или рыхлых культур. Кроме того, органогенез в гетерогенных каллусах культурной гречихи часто сопровождается появлением аномалий морфоген "за(образование антоциансодержащих листоподобных выростов, появление нитевидных светло-зеленых побегов, напоминающих мох).В отличие от гетерогенных каллусоо абсолютноее большинство плотно-глобулярных каллусов (8 иэ 9) в течение года сохраняет типичную морфологию и при переводе на органогенную среду формирует почки. Другие типы каллусов - глобулярные. распадающиеся при культивировании на отдельные. не связанные между собой глобулы. образуют на органогенной среде корни и очень редко почки; рыхлые культуры либо совсем не способны к органогенезу, либо образуют отдельные корни.Вследствие того, что гетерогенные каллусы не являются морфологически стабильными, а глобулярные и рыхлые, хотя и сохраняют морфологические особенности в течение длительного времени культивирования, однако не способны к почкообраэованию, целесообразно использование каллусов плотно-глобулярного типа для ре. генерации растений культурной гречихи,У татарской гречихи два типа каллусных культур, различающихся по морфологии: гетерогенные каллусы и гетерогенные каллусы с блестящими структурами белого или желтого цвета. Первый тип каллуса - корне- образующий, второй при переводе на орга. ногенную среду активно формирует почки, Морфологические характеристики и способность к регенерации у гетерогенных культур с плотными структурами сохраняется в течение 18 мес. и более,Таким образом, для сохранения высокой регенерационной способности каллусов при их длительном культивировании необ.ходимо провести отбор каллусов опреде 1704715ленного морфотипа -плотно-глобулярных (табл. 2, 1 морфотип) или гетерогенных с блестящими плотными структурами белого или желтого цвета (морфотип 2).Как видно из табл. 2 (вариант 8), выход таких каллусов коррелирует с возрастом эаоодыша, они возникают только на зародышах 0,5-3 мм длины в случае культурной гречихи и на зародышах 0,5-2 мм длины в случае татарской гречихи.Вследствие того, что описанные типы каллусов сохраняют стабильную морфологию и высОкую регенерационную способность, по крайней мере в течение 18 ч (табл.3), то для последующего субкультивирования отбирают только такие морфотипы калл усов.Пересаживают культуры каждые 25-40 дней, для индукции и поддержания используют среду Гамбурга В 5, дополнительно содержащую. мг/л: никотиновую кислоту 0,1-0,5; бакто-агар 7000 - 8000; и гидролизат казеин 1500-2000; ИУК 0,1-0,5; НУК 0.3-0,5; кинетин 0,2-0,4.Как видно иэ табл, 4, эта среда является наиболее оптимальной, Уменьшение концентрации перечисленных компонентов1 (вариант среды 1) снижает скорость роста каллусных культур и способствует формированию каллусов глобулярного типа. Концентрации компонентов сверх оптимальных (вариант 4) способствует образованию корней и увеличению выхода рыхлых каллусов, Глобулярные и рыхлые культуры (фиг. 1) не способны к формированию почек.Использование исходной среды Гамбурга В 5 для поддержания каллусов гречихи с высокими морфогенетическими потенциями является неприемлемым. На этой среде можно индуцировать появление различных типов каллусов, в т.ч, и плотноглобулярных, однако поддерживать дальнейший рост каллусов этого морфотипа не удается; после 1-2 х пассажей на исходной среде Гамбурга В 5 каллусы приобретают темно-коричневую окраску, Морфорлогически каллус представлен многочисленными глобулярными образованиями, Гистологический анализ таких каллусов выявил их специфичную органиэацию: в цен 1 ре отдельной глобулы находится меристематическая эона, окруженная сверху обкладкой иэ крупных клеток паренхимного типа.Такой тип каллуса на среде Гамбурга В 5(беэ модификаций) можно было поддерживать не менее года, однако он отличается медленным ростом и на регенерационной среде формирует только корни.При выращивании каллусов на исходной среде Гамбурга В 5 идет селекция опре 40. чение 18 мес. Способ опробирован на двух видах гре 45 50 55 5 10 15 20 25 30 35 деленных типов тканей, не позволяющая поддерживать рост калчусов с высокими морфогенетическими потенциями (способн ы х образо вы вать почки),Почкообраэование получают на питательной среде Гамбурга В 5, содержащей в качестве фитогормонов 1-2,5 мг/л БАП и 0,1-0,2 мг/л ИУК. Через 1,5-3 недели после пересадки каллусных культур на органогенную среду отмечают массовое появление стеблевых почек. С целью получения необходимого объема однородного материала почки размножают путем индукции адвентивных побегов с использованием среды для регенерации или среды с пониженным содержанием БАП или зеатина (1 - 0,5 мг/л). Использование последней среды в пассаже, предшествующем пересадке регенеранта на укоренение, способствует вытягиванию стебля, что облегчает выделение единичного побега иэ клона почек и укоренение его на агаре. Через 5-6 дней после высаживания на среду корнеобразования у растеньиц появляются первые корни, через 2-2,5 недели регенеранты имеют 4-5 листьев и готовы. к пересадке в почку. Укорененные растения - регенеранты 5-6 см высоты высаживают в бумажные стаканчики под стеклянный колпак, в течение 1-1,5 недель растения закаливают, постепенно увеличивая продолжительность нахождения на открытом воздухе, после его переносят в условия теплицы или вегетационного домика и выращивают до полного созревания семян, При получении и культивировании каллусов Раооругогп еасоептогп и Раооругоа таагсогп описанным способом высокая регенерационная способность каллусных культур сохраняется по крайней мере в течихи: культурной (сорт Казанская крупноэерная) и татарской (К). Использование предлагаемого способа позволяет проводить ускоренное размножение уникальных генотипов гречихи, а также увеличить выход растений - регенерантов гречихи с широким спектром изменчивости вследствие сохранения высокой регенерационной способности каллусов при длительном их культивировании.Формула изобретения Способ размножения гречихии Иго, включающий вычленение эксплантатов, культивирование их на питательной среде до получения первичной каллусной ткани, субкультивирование первичной каллусной ткани и последующую пересадку ее на питательную среду для индукции органогенеэа и получения растений-регенерантов, о т л и1704715 Влияние продолжительности культивирования эксплантатов на выход Д-каллусовТаблица 2 Зависимость выхода каллусов определенного типа от длины зародышаУч а ю щ и й с я тем, что, с целью сохранения высокой регенерационной способности каллусной ткани при длительном субкультивировании, в качестве эксплантатов вычленяют незрелые зародыши размером 0,5-Э,О мм, которые культивируют до получения первичной каллусной ткани в течение 40-60 дней, при этом культивирование аксплантатов и субкультивирование каллусной ткани осуществляют на питательной среде Гамборга В 5, в которой содержится 0,1-0,5 мг/л никотиновой кислоты, и дополнительно вводят в нее 15002000 мг/л гидролиэата каэеина,0,1-0,5 мг/л ИУК, 0,3-0,5 мг/л НУК, 0,2-0.4 мг/л кинетина и 7000-8000 мг/л бакто-агара, причем для 5 субкультивирования отбирают первичнуюкаллусную ткань, представленную плотными глобулярными обраэованиями белого, светло-желтого цвета или мягкими комочками серого или светло-коричневого цвета, 10 включающими блестящие плотные структуры белого или желтого цвета.Таблица 110 1704715 Таблица 3 Таблица 4 ф - указаны варьируемые компоненты, в качестве основы (п.5) взята питательная среда Гамбурга В 5.104715 го охаю уюта п оставитель С,Кувае ехред М.Моргентал,Шите еда рик ректо ский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 роизводственно-из акаэ 140 Тираж Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5