Способ культивирования каллусной ткани

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(ф 1 М Кп 3 А 01 Гт 7/00 Государствеииый комитет СССР по делам изобретеиий и открытий(54) СПОСОБ .КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ Изобретение касается, общих вопросов ботаники, а именно технологии вы ращивания пересадочных культур рас-тительных тканей, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ, в различных отраслях проьаааленности: парфюмерной, пищевой, медицинской.Известен способ культивирования каллусной ткани на твердой агаризованной питательной среде, при котором в стерильных условиях в боксе предварительно простерилиэованными инструментами каллусную ткань делят на небольшие участки, в качестве инокулята для посадки отбирают светлые молодые участкиЦ,Известен способ, при котором в качестве инокулята используют молодые активно профилирующие участки ткани 2.Известен способ культивирования гомогенных неорганизованно растущих калдусных тканей37. При этом способе культивирования в качестве инокулята используют верхнюю и среднюю зоны каллусной ткани. Нижнюю, контактирующую со средой, часть ткани удаляют.3 Йедостатком известных способовявляется низкий выход биомассы.Цель изобретения - увеличениевыхода биомассы при сохранении стабильности ткани.Эта цель достигается тем, чтосогласно способу культивированиякаллусной ткани, преимущественноженьшеня, на агаризованной питательной среде, заключающемуся в выращивании ее в закрытой емкости в темноте при температуре 26+1 С и относительной влажности 702, пассировании в несколько емкостей, удалении опробковевших некротизтлрованныхи контактирующих со средой выращивания частей ткани и последующем высушивании части ее для приготовленияэкстракта и пассировании остальнойчасти для дальнейшего культивирования, после удаления опробковевшихнекротизированных частей ткани дляпассирования используют ткань из нижней, примыкающей к среде выращивания, зоны каллуса с процентом делящихся клеток 1,4-1,71 а для высушивания и приготовления экстракта -ткань верхней и средней зоны с процентом делящихся клеток 0,2-0,5 и З 0 0,8-1,2 соответственно, 974971ЦИНК 4-"НОКИСЛ 4,4Калий иодистыйНатрий молибденовокислыйХлорид кобальтаКупорос медный 8,60,82 0,250,0250,025 Ростовые нещества 0,4 80 30000Хелат железа Макроэлементы Нитрат аммония Кальций азотнокислыйКальций хлористыйМагний сернокислыйКальций фосфорнокислый одноэамещенныйМикроэлементы 1650 1900 440 Х 1000 370 2045 1000 400 р(л 50 60 170 6,2 Борная кислота Марганец серно-кислый 22,3 65 В основу предлагаемого стособаположены данные исследования по определению митотической активности ипродуктивности различно удаленныхот среды зон каллусной ткани.Было проведено опреде 11"4 ие митотического индекса трех зон каллуснойткани (деление на эоны условно в зависимости от удаления от среды выращивания). Индекс определяли по отношению числа делящихся клеток к общему числу клеток,Установлено, что в первую неделюкультивирования число делящихся клеток в верхней, средней и нижней зонах эксплантатов практически совпада ет и составляет от 2 до 3.Начиная с 6 сут количество делящихся клеток н верхней зоне каллуса падает и остается на низкомуровне в течение всего цикла культивирования, достигая к 30 сут 0,20,5. Количество делящихся клетокв нижней зоне сохраняется на высоком уровне в течение всего пассажане менее 1,5.25Для средней зоны характерно снижение числа делящихся клеток на 510 сут культивирования до 0,5-0,8,затем количество делящихся клетоквозрастает к 16 сут и ннонь планомерно снижается к концу пассажадо 0,9-1,2,Исследование митотической активности верхней, средней и нижней зонкаллуса, рассаженных в отдельные сосуды, показало, что наибольшее чис- З 5ло делящихся клеток отмечается винокуляте, полученном из нижнейзоны каллуса. Число делящихся клеток нозврастает к 5 сут до 2 иостается на высоком уровне в течение всего пассажа 1,4. Наименьшеечисло делящихся клеток характернодля инокулята, полученного из верхней зоны каллуса на 5 сут - 0,9,к 30 сут - 0,4. 45П р и м е р. Для получения в пересадочной культуре гомогенно растущей биомассы испольэовали модифицированную питательную среду состава,мг,/л:50 2 ЭДТА 37,3Железо сернокислое закисное 27,8В тщательно нымытую и высушеннук посуду (250 мл колбы) разливали по 50 мл питательной среды. Колбы укупоривали натномарлевыми пробками Сосуды со средой автокланировали в автоклавв для уничтожения микроорганизмов при 0,7-0,8 атм 15 мин, после чего сосуды вынимали и ставили на ровную поверхность для застывания среды, Бокс стерилизовали бактерицидными лампами, Инструменты стерилизовали в суховоздушном шкафу при 150-200 фС, завернутые в бумагу Крафт. Так же стерилизовали чашки Петри.В боксе перед началом работы инструменты опускали в спирт и прожигали на спиртовке. Остужали, положив под крышку н стерильную чашку Петри.В качестве трансплантанта исполь" эовали каллусную ткань нижней, прилегающей к питательной среде, эоны каллуса с процентом делящихся клеток в момент пересадки 1,3.Колбы с пересаженной тканью помещали в культуральную комнату в стационарные условия. Цикл культивирования 30 сут. За это время урожай биомассы составил 410 г/л по сырому весу. Расчет: вес инокулята в моментпересадки 1 г, вес инокулята через30 сут культивирования 20,5 г, объемсреды 50 мп, отсюда20,5 50 Ткань верхней и средней эоны отбирали на сушку, из высушенной ткани приготовляли экстракт,В таблице приведены данные продуктивности культуры ткани женьшеня974971 Вес исходнсго инокулята, г Место иссле- дования Вес каллуснойткани на 30-есутки, г Продуктнвность,г/л14 ВерхСередине 280 320 Ниэ 20,5 410 1Контроль 15,7 314 Формула изобретения Составитель Г.БрестюкТехред Т.Маточка Корректор Н.Король Редактор Н.Разумова Заказ 8858/2 Тираж 699 Подписное ВНИИХИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 в зависимости от координации относительно испытательной среды точек Таким образом, предложенный способ культивирования каллусной ткани позволяет увеличить выход биомассы на агариэованной питательной среде при сохранении стабильности ткани беэ изменения размера первоначального инокулята и компонентов питательной среды,Ожидаемый экономический эффект составляет 4,94 тыс. руб. на 1 кг сухой биомассы.1 Способ культивирования каллусной ткани, преимущественно женьшеня, на агаризованной питательной среде, заключающийся в выращивании ее в закрытой емкости в темноте при температуре 2611 фС и относительной влажности 70+2, пассирования в несколько емкостей, удалении опробковевших ,некротизированных и контактируюцих со средой выращивания частей ткани и последующем высушивании числа ее для приготовления экстракта и пассисъема исходного инокулята при циклекультивирования 30 сут. ровании остальной части для дальнейшего культивирования, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода биомассы при сохранении стабильности ткани, после удаления опробковевших некротиэированных частей ткани для пассирования используют ткань иэ нижней, 5 примыкающей к среде выращивания, эоны каллуса с процентом делящихся клеток 1,4-1,7, а для высушивания и приготовления экстракта - ткань верхней и средней эоны с процентом ЗО делящихся клеток 0,2-0,5 и 0,8-1,2,соответственно. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе35 1. Цитологическая и морфологическая характеристика разных штаммовв культуре ткани моркови. Канд. дисс.М., ИФР АН СССРНГ 1973.2, Ьа сц 1 г,иге Йеэ Т 1 эзйе череСаиК.40 Раг 1 э, 1959, р. 148,3. Бутенко Р.Г. Культура тканейи фиэиолоГия морфогенвэа растений.М., АН СССР, с. 116 (прототип).