Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию

(19) я)5 С 12 М 7/О АНИЕ И ОБРЕТЕНИ ый институтИнститут хи капов, блик и е ГоггпаьопроПогпуоПбз167 - 182,1 ЯВЛЕНИЯВАНИ 1 Оедицине, вет быть исоб.%; раствор Эрла или ре Эрла до 100,0 об.% ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Киевский государственнусовершенствования врачей имии поверхности АН УССР(56) Оо 1 Ьессо ВЧор М., Раццапс 3 1 зо 1 ас 1 оп оГ роге 11 пез в 11 Ьч 1 гоз. - .1.Ехр, Мед, 1954, У,99, р,Авторское свидетельство ССМ 478059, кл. С 12 К 7/00, 1975.(54) СРЕДА ПОКРЫТИЯ ДЛЯ ВЬВИРУСОВ ПО БЛЯШКООБРАЗО(57) Изобретение относится к мчастности к вирусологии, и мож Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях.Известна плотная питательная среда для выявления и изоляции вирусов полиомиелита по бпяшкообразованию, включающая в себя растворы Эрла, нейтрального красного, куриный эмбриональный экстракт и агар Дифко,Недостатком известной среды для выявления вирусов по бляшкообразованию является непригодность агарового покрытия для многих перевиваемых культур клеток, которые быстро дегенерируют и пользовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях. Цель изобретения- повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию. Предлагаемая среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота, бикарбонат натрия, отличается тем, что она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующем соотношении компонентов: аминоэтоксиаэросил 0,03 - 0,05 мас,%; бикарбонат натрия 0,2 - 0,3 об, %; сыворотка крупного рогатого скота 3,0 - 5.0ввей отслаиваются от стекла. Кроме того, на эффективность выделения и титрования виру- О сов по бляшкообразованию отрицательное влияние оказывают содержащиеся в агаре вирусные ингибиторы - сульфатированные полисахариды, а также фотодинамическое "Ь действие нейтрального красного, Трудоемким и материалоемким является процесс приготовления куриного эмбрионального экстракта и контроль на его стерильность.Существенным недостатком агарового покрытия является сложность его приготовления; отдельное приготовление растворов. А и В; необходимость расплавления агара Дифко и нанесение на клетки покрытия с температурой 43 "С (быстрое застывание20 25 30 50 агара при более низкой температуре); необходимость проведения ряда манипуляций в темноте.Необходимость использования дорогостоящих термостатов с подачей СО 2 для поддержания определенных параметров рН среды существенно ограничивает возможности применения метода титрования вирусов под агаровым покрытием.Известна жидкая питательная среда покрытия, содержащая раствор Эрла, бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота, природный алюмосиликат бентонит.Недостатками жидкого питательного бентопитового покрытия являются трудоемкость и сложность получения геля бентонита иэ природного сырья. Природный ал юмосиликат бентонит характеризуется нестабильностью химического состава и различной дисперсностью в зависимости от месторождения, что затрудняет получение геля стандартизованного состава, отсутствует также выпуск бентонитового геля в промышленных масштабах.Цель изобретения - повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов побля шкообразовани 1 о. Поставленная цель достигается, тем что в раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла вносят бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота иаминозтоксиаэросил с рН покрытия 7,9 приследующем соотношении компонентов, :Аминоэтоксиаэросил 0,03 - 0,05Бикарбонат натрия 0,2 - 0,3Сыворотка крупногорогатого скота 3 - 5Раствор Эрла или среда199 на растворе Эрла До 100Предлагаемую среду покрытия выгодного отличает ее высокая стабильность в течение длительного времени перед использованием (6 мес при температуре хранения 4 С) без изменения свойства как отдельных ее компонентов, так и покрытия в целом. В то же время, агаровое покрытие не обладает стабильностью свойств, так как может быть приготовлено только ех 1 еароге и его качество, а также качество результатов выявления вирусов по бляшкам зависят от температуры покрытия во время его приготовления и в момент внесения на зараженн ые клеточные культуры (43 С). Бентонитовое питательное покрытие не обладает стабильностью из-за различий физико-химических свойств самого геля бентонита, что связано с месторождением природного сырья, нестандартиэированными условиями приготовления бентонитового геля, а также со способностью частиц бентонита агрегироваться в конгломераты при хранении уже готового покрытия.Функциональное назначение аминоэтоксиаэросила в покрытии для выявления вирусов по бляшкообразованию состоит в локализации вируса на клеточном моно- слое, абсорбции на своей активной поверхности "свободного" вируса, который не проник в клетку во время предварительной инкубации вируса и клеток; в абсорбции частиц аминоэтоксиаэросила на поверхности неповрежденных вирусом клеток; а также в визуализации вирусных бляшек на клеточном монослое без применения дополнительных методик окрашивания клеток: вирусные бляшки представляют собой прозрачные пятна четкой формы и размеров на матово-белом фоне неповрежденных клеток, покрытых аминоэтоксиаэросилом.П р и м е р 1. Выявление вируса полиомиелита 1 типа, штамм Ос,2 аЬ,К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил, предварительно простерилиэованный сухим жаром при 160 - 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике.Взвесь клеток Чего при концентрации 300 тыс, кл,/мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования монослоя на дне. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 ОС 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия, Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточногоионослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).В табл,1 приведены результаты титрования полиовирусатипа, штамм Ос, 2 аЬ в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия.П р и м е р 2. Выявление вируса поли- омиелита 11 типа, штаммРсЬ, 2 аЬ,К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованный сухим жаром10 15 20 25 30 35 40 50 55 при 160 - 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике.Взвесь клеток Чего при концентрации 300 тыс,кл./мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращива,ат под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят ва флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С 60 мин, затем заливают З.мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживэния в термостате при 37 С, Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитываат число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается кэк БОЕ (бляшкаобразующая единица),В табл.2, приведены результаты титрованля палиовлруса И типа, штамм Рсп 2 аЬ в зависимости от концентрации аминоэтаксиаэросила и рН в среде покрытия.П р и м е р 3. Выявление вируса Каксэки В 1, штамм Сопп,К 95 мл стерильного раствора Эрла добавлвот аминоэтоксиазрасил, предварительно. простерилизованный сухим жаром при 160 - 170 С втечение 1,5 ч,интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 ОС в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия, Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится да применения в бытовом холодильнике.Взвесь клеток Чего при концентрации 300 тыс.кл./мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С 60 мин, затем заливают 3 мл. среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37 С. Для учета результатов флакончики пе- . реворачивают вверх дном и подсчитывают числа прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного моно- слоя, Одна. бляшка (празрачное пятна) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообрэзующая единица).В табл,З приведены результаты титровэния вируса Коксаки В 1, штамм Соппв зависимости от концентрации аминаэтоксиэзросилд и рН в среде покрытия.П р и м е р 4. Выявление вируса Коксэки В 3, штамм Капсу.К 95 мл стерильного раствора Эола добавляют дминозтоксиаэросил, предварительно простерилизаванный сухим жаром при 160 - 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят Б мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительна прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике.Взвесь клеток Чего при концентрации 300 тыс.кл./мл вносят в стерильнье пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монаслоя. Вируссадержащий материал или его разведения (деся-. тикратные) вносят во флаконы с клеточным монослаем, инкубируют в термостате при 37 ОС 60 мин, затем заливаот 3 мл среды покрытия, Результаты учитывают через 48 чпосле выдерживания в термостате при 37 С, Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фане неповрежденного клеточного манослая. Одна бляшка (празрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкоабразующая единица).В табл.4 приведены результаты титрования вируса Каксаки В 3, штамм Кэпсу в зависимости от концентрации аминоэтаксиаэросила и рН в среде покрытия.П р и м е р 5. Выявление вируса Каксаки В 6, штамм Зспв 11.К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиазросил, предварительно прастерилизованный сухим жаром при 160-170 С в течение 1,5 ч., интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сывооотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия, Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике,Взвесь клеток Чего при концентрации 300 тыс.кл/мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают пад резиновыми пробками в течение 24 ч до образования нд дне монослоя, Десятикрат 1694641ные разведения вируса Коксаки В 6, штамм Ясйгпп вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после 5 выдержиоания о термостате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозра нных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. 10 Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).В табл.5 приведены результаты титрооания вируса Коксаки В 6, штамм ЯсЬп 1 г в 15 заоисимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН о среде покрытия,П р и м е р 6. Выявление вируса Коксаки В 6, штамм Напппоп.К 95 мл стерильного раствора Эрла до баоляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованный сухим жаром и ри 160 - 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого ско а, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, дббавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна о течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике, 30Взвесь клеток Нерпри концентрации 300 тыс.кл,/мл вносят о стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч.до образования на дне монослоя, Десятикрат ные разведения вируса Коксаки В 6, штамм Навтоп вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют о термостате при 37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч 40 после выдерживания в термостате при 37 С, Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного моно слоя, Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и в ы ракается как БО Е (бля шкообразующая единица).50В табл.6 приведень 1 результаты титрования вируса Коксаки В.6, штамм Натпзоп о зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия. П р и м е р 7. Выявление вируса оезикулярного стоматита, штамм Индиана.К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил предварительно простерилизованный сухим жаром при 160 - 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия, Приготовленная среда покрытия стабильна о течение 6 мес и более и может хранится о бытовом холодильнике до применения.Взвесь клеток Нерпри концентрации300 тыс.кл,/мл вносят в стерильные, пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на.:дне монослоя. Десятикратные разведения вируса веэикулярного стоматита, штамм Индиана вносят оо флаконы с клеточным монослоем, инкубируют о термостате при 37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдержиоания в термо-, стате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного моно- слоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).В табл.7 приведены результаты титрования вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытияФормула изобретения Среда покрытия для выявления вирусовпо бляшкообразованию, содержащая раствор Эрла, или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота,. бикарбонат натрия, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности и стабильности среды, она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующих соотношениях компонентов;Аминоэтоксиаэросил 0,03 - 0,05 мос.% Бикарбонат натрия 0,2 - 0,3 об.% Сыворотка крупногорогатого скота 3,0 - 5,0 об,% Раствор Эрла или среда199 на растворе ЭрлаДо 100 об.%1694641 Т Примечание,х учет невозмомен из за неспецифицескои дегенерации клеточногомонослоя; Таблица 2хх - учет затруднен иэ-эа низной концентрации аминоэтоксиаэросилав среде (не хватает сообента для покрытия всего монослоя),чет невозмонослоя;чет затрудила в сред ен из-за неспецифической дегенера точного ен иэ-эа низкой конце(не хватает сорбента ации аминоэ я покрытия,и н и из"за неспецифической дегенерации клеточногоаб 4 н из"за низкой концентрации аминоэтоксиаэросилватает сорбента для покрытия всего монослоя). и клеточно ц ен из-за неспецифической Легенер х/- учет невозм монослоя; хх - учет затруд в среде (нее ч оксиаэросил монослоя) ции амин ытия все концент для по н из"за низ ватает сорб-е.учет невозможен из-за неслециФической дегмонослоя;учет затруднен из-за низкой концев среде (не хватает сорбента для и клеточного б л и ц а нтрации аминоэтоксиазроси покрытия всего монослоя). еча може з-за неспецифическои дег ерации клеточн бл анен из-за низкой концентрац е хватает сорбента для покрыт х - учет за инозтоксиаэросиласего монослоя). в сред ецифической дегенерации клеточно р и м е ч а н и е. х-уч зможен из-за несмохх-уч днен из-за низкоС е хватает сорбент нцентрации аминоэтоксиаэросидля покрытия всего монослоя). ктор М.Демчи,Моргентал Те актор М.Пе аказ 4130 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 и ГКНТ СССР оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина нне,х - учет невомоноислоя; ет неванослояет затруреде ( н