Способ получения ноурзеотрицина

(46) 30 231949 (48) 15.01,863571/13 тносится к микробиолоен ности, в частнос т;1 к нтибиотиков, Штамм е 2 МЕТ 33700, 2 МЕТ 708 культивируют в фере, которая в качестве иссодержиг кукурузный ный крахмал и пшеничных аэробных условиях процессе ферментации ичину рН на уровне 5,0 - ость процесса 68 - 144 да разовое или дробное, ина от 6 до 15 г/л куль- и. 3 з.п, ф-лы, 5 табл,0.84С 12 Р/2550,83. 1 1.9 Наро ОО)"Йена пр фарм" (72) М манн,Меннер,Гиллигер ин Рот, т Гроссе, с, Юлиан тер Планка 3 (088.8) ихаэль Матиа Март ельму р Ге и Гун 5.779. Эрнст ИПетер-ЮГарольфридрКедель(ОО) ахим Боррген Мюлд Бокер, х Бергтер, Ингеборг Ганс-ЛВернеГеллер53) 61 ля, а также веществ, ингибирующих перенос аминокислот.В публикации (б гаГе О В осег Н, йеи Ьагс О. опс ТЬгигп Н. Веццарче Веепйоззопд без йоцгзеотЬгспЬозупйезе согсз о-Атпо Ьепоезаоге и Кц 1 цгеп сез Ятгертогпусез поцгзе А 3890 Ь, -2, А 9. МгоЬо 1974, 14, 659 - 673) описывается питательная среда, в которой кукурузный крахмал используется в качестве источника углерода. В этом процессе с использованием исходного штамма Зтгертопусез поцгзе А 3890 Ь тоже с прибавлением ингибиторов названных типов и ингибиторов, описываемых в описании к патенту ЧЧР А 61 К/223321, достигается настолько незначительный выход ноурзеотрицина, что экономическое производство оказывается невозможным,Изоб гической способу биотика ропное д экономи зяйства иИзврицина,вание3890 Ьвтент Гд17/00, 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ретение относится к микробиолопромышленности, в частности к ферментативного получения антинуорзеотрицина, имеющего .эрготействие, а в то же время и важное ческое значение для сельского хофармацевтической промышленноестен способ получения ноурзеотпредусматривающий культивироштамма Ятгертогпусез поигзе А глубинных аэробных условиях (па- Р М В/Р А 61 К/223321, кл. Н 04 Я 983). Однако в данном способе используют ингибиторы дыхательной цепи типа щелочных азидов, бренцкатехинов и/или амита(54) СПОСОБ ПОЛ ЦИНА(57) Изобретение о гической промышл производству а 51 гер 1 оаусез поцгз 43701 или 2 М ЕТ 43 ментационной сред точника углевода крахмал, картофел ную муку, в глубин при 28 - 32 С, В поддерживают вел 7,0, Продолжитель ч. Введение углево Выход ноурзеотриц турал ьной жидкост ЧЕНИЯ НОУРЭЕОТРИ 169464210 15 Цель изобретения - получение ноурзеотрицина достаточно эффективным способом на малогексозных, в частности малоглюкозных, питательных средах. В основу изобретения положена задача представить удобный в техническом отношении способ, который позволяет осуществить промышленное производство ноурзеотрицина посредством малогексоэного, димер-, олигомер- или полимерсодержащего источника углерода в питательной средеНайдено, что определенные ноурэеотрицинопродуцирующие штаммы, отличающиеся достаточной амилолитической активностью, с использованием крахмала в качестве первичного малогексозного полимерного источника углеводов накапливают в питательной среде большие количества ноурзеотрицина. Эти штаммы накапливают ноурзеотрицин в таких больших количествах также беэ прибавления ингибиторов дыхательной цепи и, соответственно, переноса аминокислот. Такие результаты получены, например, на ноурэеотрицинопродуцирующих штаммах, депонированных в коллекции Института под номером ЕМЕТ 43700, ЕМЕТ 43701 и МЕТ 43708.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Вегетативный посевной материал используемого ноурзеотрицинообразующего штамма, который получен путем выращивания в нескольких стадиях из консервированного мицелия, служит для засева ферментационных питательных сред.Среды имеют следующий основной состав.крахмал, в частности кукурузный, в качестве основного источника углеводов в количестве 50 - 150 г на 1 л;комплексные источники азота в виде арахисного шрота или соевого шрота в количестве 5 - 25 г на 1 л и/или,кукурузный экстракт в количестве 1 - 10 г на 1 л;неорганический источник азота, например сульфат аммония в количестве 5 - 15 г на 1 л;карбонат кальция, например в виде мела, в количестве 4 - 20 г на 1 л;пеногаситель, например пеногаситель на силиконовой или полиэтиленовой основе или/и растительные жиры.В течение 72 - 196-часовой ферментации при температурах 28 - 30 С с дополнительным прибавлением и без него ожиженных концентрированных полимерных источников углеводов с использованием ферментных препаратов с амилолитической активностью, например пивоваренного фермента, а также при под 20 25 30 35 40 45 50 55 держании кислотности культуральной жидкости прибавлением 25-ного раствора гидроокиси аммония на уровне рН 5,0 - 8,0, предпочтительно при рН 5,5 - 6,5, достигается высокая концентрация ноурзеотрицина в культуральной жидкости,Выделение и очистку ноурэеотрицина проводят известным путем,П р и м е р 1. Из консервированного мицелия штамма 31 герсоеусез попугае ЕМЕТ 43700 выращивают предварительные культуры в широкогорлых колбах емкостью 500 мл и 100 мл и, соответственно, в колбах Эрленмейера емкостью 2,5 л по 400 мл питательной среды, имеющей следующий состав; в 1 л водопроводной воды содержится 15 г арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта 100 сухого вещества, 40 г мальтозы, 5 г сульфата аммония, 6 г карбоната каЛьция. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,5 - 6,8. Стерилизацию проводят в течение 35 мин при 121 С.Культуру первого пассажа культивируют в течение 48 ч при 29 - 30 С на круговой, качалке, После получения достаточного количества мицелия по 20 мл суспензии предварительной культуры используют в качестве посевного материала для второго пассажа и выращивают в течение 24 ч в тех же условиях.Для засева 10 л питательной жидкости в 15-литровом ферментаторе используют содержимое двух колб второго пассажа культивирования. Состав питательной среды следующий; на 1 л водопроводной воды берут 80 г кукурузного крахмала, 25 г арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта, 10 г сульфата аммония, 3 г подсолнечного масла, 5 г мела острова Рюген. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,8 - 7,0, Стерилизацию проводят в течение 30 мин при 121 ОС. Во время ферментации дважды прибавляют по 300 г крахмала (после обработки известным образом пивоваренным ферментом), Кислотность ферментационного раствора поддерживают постоянной на уровне рН 6,2 при помощи гидроокиси аммония, По окончании 144-часовой ферментации с числом оборотов 360 об/мин и скоростью аэрации 0,75 об/об/мин получают 7,2 г ноурзеотрицина на 1 л культуральной жидкости.П р и м е р 2. В две колбы на качалке (2,5 л), содержащие каждая по 400 мл питательной среды, засевают по 0,5 мл суспензии консервированного мицелия штамма З.пацгзе ЕМЕТ 43701 и культивируют в течение 48 ч при 29 С на круговой качалке. Питательная среда имеет следующий состав; на 1 л водопроводной воды берут 15 г екукурузного крахмала, 15 г соевого шрота, 0,3 г дигидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 1 г карбоната кальция. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,5-6,8. Стерилизацию проводят в течение 30 мин при 121 С.Соединенное содержимое первыхпредварительных культур используют для засева 250-литрового посевного фермента- тора, содержащего 150 л питательной среды такого же состава, как у первой предварительной культуры. Культивирование осуществляют в течение 40 ч при 29 С с числом оборотов 240 об/мин и скоростью аэрации 0,5 об/об/мин, 45 л полученной посевной культуры (6,8 - 7,0) используют в качестве инокулюма для засева 400 л питательной среды в 720-литровбм ферментаторе. Культивирование производят при скорости аэрации 1,0 об/об/мин и числе оборотов 320 об/мин при 29 С, Кислотность культуры автоматически поддерживают постоянной на уровне 6,2 прибавлением 25 о -ного раствора гидроокиси аммония,Питательная среда имеет следующийсостав:на 1 л водопроводной воды приходится 60 г кукурузного крахмала, 10 г арахисового шрота, 2 г кукурузного экстракта, 8 г сульфата аммония, 0,05 г сульфата цинка, 0,03 г сульфата марганца, 0,5 г подсол.нечного масла, 3,75 г мела острова Рюген, Кислотность питательной среды устанавливают перед стерилизацией 6,8 - 7,0. Стерилизацию производят острым паром при 120 С в течение 30 мин, В процессеферментации, т,е. на 30, 45, 70, 100, 120 ч, прибавляют к среде по 6 кг кукурузного крахмала, ожиженного пивоваренным ферментом до концентрированного раствора (около 30- ного), После 120-часовой ферментации получают 550 л культуральной жидкости, которая содержит ноурзеотрицин в концентрации 6,53 г на 1 л.П р и м е р 3. Для выращивания посевного материала лиофилизированный на глюкозожелатине высушенный консервированный мицелий (вес брутто около 300 кг) штамма 3. поцгзе Е 1 МЕТ суспендируют в 3мл физиологического раствора пивоваренной соли, 0,5 мл питательной среды первого пассажа. Питательная среда имеет следующий состав: иа 1 л водопроводной воды берут 40 г глюкозы, 15 г соевого шрота, 0,3 г гидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 3 г карбоната кальция. Перед стерилизацией устанавливают рН среды 6,5. По 400 мл этой среды заливают в закрываемые ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 2,5 л. Стерилизацию проводят в автоклаве при 120 ОС в течение 35 мин. Засеянные культу 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ры инкубируют на круговых кэчалкэх при 29 С в течение 48 ч, 800 мл получаемой культуральной жидкости первого пассажа используют для второго пассажа - для засева 180 л среды, стерилизованной паром (45 мин при 120 С), такого же состава, кэк в первом пассаже, содержащейся в ферментаторе иэ высококачественной стали общий объем 250 л). Культивирование осуществляют в течение 40 ч (рН 5,1 - 5,3) при 28 - 29 С, числе оборотов 240 об/мин и скорости аэрации 1,0 об/об/мин. Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали общий объем 4200 л), наполненный 2500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала, 2,5 г глюкозы, 12 г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 6 г кэрбоната кальция,0,5 г сульфата цинка, 0,5 г полипропиленгликоля.Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией 6,2, Стерилизацию питательной среды (без глюкозного компонента) проводят и зм путем предварительного нагрева паром рубашки до 75 С и последующего нагрева острым паром до 120 С в течение 15 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в виде 40-ного водного раствора нагревом до 120 С в течение 30 мин, Перед засевом устанавливают серной кислотой исходную кислотность питательной среды 6,8 + 0,1,Засеянную 4 О инокулюмэ второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение 140 ч при 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин 20 - 140-й часы) и при избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 180 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25 оь-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6,0+0,1 после физиологически обусловленного медленного снижения исходного значения рН.В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие количества продукта (см.табл.1).П р и м е р 4, Предварительное культивирование производят по примеру 3 с использованием штамма Е 1 МЕТ 43708. Для оснОвной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 720 л), который наполнен 500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5г кукурузного крахмала, 2,5 г глюкозы, 12 г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 6 г карбоната кальция, 01 г сульфата железа , 0,5 г полипропиленгликоля. Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2. Стерилизацию питательной среды (беэ глюкозного компонента) проводят и зтц предварительным нагревом паром рубашки до 750 С и последующим нагревом острым паром до 120 С в течение 15 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в Форме 500 -ного водного раствора нагревом до 120 С в течение 30 мин. Перед засевом при йомощи серной кислоты производят установку начальной кислотности питательной среды 6,8+0,1. Засеянную 4 инокулюма второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение 116 ч при 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О -20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 - 116-й часы) при избыточном давлении 0,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25-ным раствором гидробкиси аммония на уровне 6,0+ 0,2 после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.2,).П р и м е р 5, Предварительное культивирование проводят по примеру 3 и используют штамм 43708.Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 450 л), который наполнен 300 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 120 г кукурузного крахмала; 5 г глюкозы, 24 г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 6 г карбоната кальция, 0,5 г сульфата цинка, и 0,5 г полипропиленгликоля.Для ожижения большой доли полимерного источника углеводов используют известным образом пивоваренный Фермент., После энзиматического гидролиза крахмала вливают остаточные компоненты питательной среды. Стерилизацию питательной среды .осуществляют нагревом до 120 С в течение 15 мин. После охлаждения до рабочей температуры перед засевом при помощи серной кислоты устанавЛивают кислотность питательной среды 6,8+ 0,1. Засеянную 4 инокулюма второго пассажа культивирования ферментационную культуру культивируют в течение 124 ч при 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О-й часы)или 1,0 об/об/мин (20 - 124-й часы) при 5 избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 400 об/мин.К 16-му часу ферментации прибавляют2 мг л источник фосфора (например, дигидрофосфат калия) в Форме стерилиэован ного водного раствора, Кислотностькультуральной жидкости (рН) поддерживают постоянной на уровне.6,0+ 0,2 при помощи 25-ного раствора гид роокиси аммония после Физиологически обуслов ленного медленного снижения начальногозначения рН.В результате биологического теста вкультуральной жидкости определяют следующие концентрации продукта (см.табл.3).20 П р и м е р 6, Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм 43708.Питательная среда и ее приготовлениеидентичны представленным в примере 3. Ис пользуют два ферментатора из высококачественной стали (общий обьем 720 л), каждый из которых наполнен 500 л питательной среды.Количество инокулюма и режим процесса соответствуют условиям, представ ленным в примере 3. В ферментационнуюсреду на 12-м часу ферментации добавляют 10 мг л 1 источника фосфора (как дигидроФосфат калия) в форме стерилизованного водного раствора. Другая ферментацион ная среда добавок не содержит.В результате биологического теста вкультуральных жидкостях определены концентрации ноурзеотрицина, увеличивающиеся с различной скоростью (см.табл.4).40 П р и м е р 7. Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм ВМЕТ 43708.Для основной культуры используютФерментатор из высококачественной стали 45 (общий объем 720 л), который наполнен 500л питательной среды, имеющей следующий состав: из расчета на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала. 2,5 г глюкозы, 16 г соевого шрота, 11 г сульфата 50 аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлориданатрия, 6 г карбоната кальция, 0,13 г сульфата-гидрата алюминия, 0,5 г полипропиленгликоля, Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2.55 Стерилизацию осуществляют нагревом до120 С в течение 15 мин. После охлаждения до 29 С перед засевом устанавливают начальную кислотность питательной среды (рН) серной кислотой 6,8+ 0,1. Основную ферментационную среду, засеянную 410 1694642 Таблица 1 Табл и ц инокулюма второго пассажа культивирования, культивируют в течение 116 ч при температуре до 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20-116-й часы) при избыточном давлении 0.,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6,0 ФО,З после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.5). П р и м е р 8. Выращивание продукта З.поцгзе ЕМЕТ 43716 осуществляют по примеру 1. Для засева 15-литрового ферментатора, заполненного 10 л питательной среды, используют содержимое двух колб 2-й фазы культивирования. Питательная среда содержит в 1 л водопроводной воды 60 г картофельного крахмала, 5 г глюкозы, 10 г экстракта соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 6 г карбоната кальция, 0,5 г сульфата цинка. Стерилизацию осуществляют в течение 30 мин при 121 С, рН поддерживают постоянной на .уровне 6,2 гидроокисью аммония. Через 144 ч ферментации при числе оборотов 360 об/мин, скорости аэрации 0,75 об/об/мин и температуре 28 - 30 С образуется 2,1 г ноурзеотрицина на 1 л культуральной жидкасти,П р и м е р 9. Осуществляют способ в соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. Из питательной среды исключают сульфат цинка. Через 144 ч фер.ментации образуется 6,5 г/л антибиотика. П р и м е р 10, Осуществляют способ в5 соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. Выращивание проводятв питательной среде, содержащей в 1 л водопроводной воды 80 г пшеничной муки, 5 гглюкозы, 10 г экстракта соевого шрота, 11 г10 сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 гхлористого натрия, 6 г карбоната кальция,Через 144 ч ферментации образуется 6,9 г/лантибиотика.Формула изобретения15 1. Способ получения ноурэеотрицинапутем выращивания продуцента видаЯтгертовусез поогзе в глубинных аэробных условиях в питательной среде, содержащей источник азота, углевод и минеральные20 соли, при температуре 28 - 32 С и поддержании кислотности культуральной жидкости в пределах рН 5,0 - 7,0, о т л и ч аю щ ий с я тем, что в качестве продуцента используют штамм Ятгертоаусез поцгзе ЕМЕТ25 33700, ЕМЕТ 43701 или ЕЗМЕТ 43708, в качестве углевода в питательной среде используют кукурузный крахмал,картофельный крахмал или пшеничную мукуи культивирование ведут в течение 68 - 14430 ч2 Способ по пЛ, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что осуществляют разовое выделениеуглевода.3. Способ попп.1 и 2, отл ича ющий 35 с я тем, что осуществляют дополнительнуюдробную подачу углевода,4. Способ попп.1 - З,отл ича ющийс я тем, что кукурузный крахмал вводят после предварительной ферментативной об 40 работки.12 1694642 Таблица 3 аблица 4 аблиц Редактор М,Петров Заказ 4130 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-ЗБ, Раушская наб., 4/б изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,оставитель Г.Сми ехред М. Моргента ва Корректор О.Кравцова