Способ культивирования продуцента гиббереллинов микроскопического гриба fusarium moniliforme

Х 1/14 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТ етельств ВТОРСКОМУ нов Р 1 загшш шов 11 Иогше заключается ввыращивании продуцента на жидкой питательной среде, содержащей (мас,%):кукурузная мука 5,8 - 8,0; зеленая патока8,0 - 16,5; рапсовый шрот 0,7 - 1,8; ацетат аммония 0,28 - 0,6; калий фосфорно- Окислый однозамещенный 0,08 - 0,3; )сернокислый магний 0,005 - 0,03; сернокислый калий 0,005 - 0,03; водный раствор смеси микроэлементов 0,35 - 1,5, (Рвода остальное. При этом процесс культивирования осуществляют до содержанияредуцирующих веществ в культу ральнойжидкости 0,9 - 1,4%. В качестве микроэлементов используют мг/л: сернокислыймарганец 80, сернокислый цинк 3800, сер- лнакислая медь 400, азотнокислый кобальт ф100, борная кислота 60. Способ позволяетувеличить синтез гиббереллинов до 21003680 мкг/мл, скорость фильтрации культуральной жидкости до 8,0 - 105 мл/мин, 5табл. Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(56) Промышленный регламент на производство гнбберснба в цехе 1 ч 31, Минмедбиопром, БХЗ, утв. 22.02.88.(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА ГИББЕРЕЛЛИНОВ - МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА РЮБАМП 1 ММОЯ 1 ЫРОКМЕ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может бытьиспользовано в производстве гиббереллинов,Цель изобретения - повышение выходацелевого продукта за счет увеличения синтеза гиббереллинов и скорости фильтрациикультуральной:кидкости, а также снижениесебестоимости среды. Способкультивирования продуцентов гиббеоеллиБЫ (1 Ц 1621506 (1 З) А 10,08-0,3 200,005-0,030,005-0,03 . Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве гиббереллинов, .Цель изобретения - повышение выходацелевого продукта за счет увеличения синтеза гиббереллинов и скорости фильтрациикультуральной жидкости, а также снижениесебестоимости среды,Способ кульТивирования продуцентовгиббереллинов Ецзагщй попИОогве заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, содержащейкомпоненты при следующем соотношении,мас. О :Кукурузная мука 5,8-8,0 15Зеленая патока 8,0-16,5Рапсовый шрот 0,7-1,8Ацетат аммония 0,28-0,16Калий фосфорнокислыйоднозамещенныйСернокислый магнийСернокислый калийВодный раствор смесимикроэлементов 0,35-1,5Вода Остельное 25При этом процесс культивирования осуществляют до содержауя общих редуцирующих веществ в культуральной жидкости0,9-1,4 о В качестве микроэлементов использу- ЗОют, мгл: сернокислый марганец 8,0; сернокислый цинк 3800, сернокислая медь 400,азотнокислый кобальт 100, барная кислота60.П р и м е р 1, Для приготовления 8,0 м 35среды следующего состава, мас.:Кукурузная мука 7,5Зеленая патока 11,5Рапсовый шрот 1,4Ацетат аммония 0,4 40Калий фосфорнокислыйоднозамещенный 0,2Сернокислый калий 0,02Сернокислый магний 0,02Смесь микроэлементов, мл/л 1,0 45Вода Остальное,наливают в аппарат 3,0 мз водопроводнойводы, включают мешалку и загружают 600 кгкукурузной муки и 112 кграпсового шрота.Взвесь нагревают до 35 С при постоянном 50перемешивании мешалкой, выдерживают втечение 30 мин, затем продолжают нагревание до 85 С и выдерживают ЗО мин, послечего добавляют 0,92 м зеленой патоки, 1,6зкг сернокислого калия и 1,6 кг сернокислого 55магния. Зту порцию среды передают на стерилизацию при 143+2 С. В другой емкостив водопроводную воду в количестве 1,0 мзвносят 32,0 кг аммония ацетата, перемешивают, вносят калия фосфорнокислого однозамещенного 16,0 кг и 8,0 л смеси микроэлементов. Вторую порцию среды стерилиэуют при 143 С, Питательную среду охлаждают до 28+1 С и засевают стерильным посевным материалом, в качестве которого используют штамм РозагцптопИОогае. Готовая питательная среда должна иметь после стерилизации следующий биохимический состав:Редуцирующие вещества,9,7+0,З Аммиачный азот,0,04-0,05 рН 5,0-5,5 .Ферментацию на этой стадии оСуществляют при 28+1 С и,нейрерывным перемешиванием, расход воздуха 750250. мз/ч. Продолжительность ферментации составляет 270 м ч, Остаточное содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости 1,2, Фильтруемость культуральной жидкости определяют по количеству образовавшегося нативного раствора в единицу времени, и она составляет при дан-. ном способе культивирования 105 мл/мин. Содержание гиббереллинов в культуральной жидкости 3680 мкг/мл. Результаты ферментации Гозагцв еопИОогве приведены в табл 1.П р и м е р 2. Питательную среду следующего состава, мас,:.Кукурузная мука 8,0Зеленая патока 16,5Рапсовый шрот 1;8 Калий фосфорнокислыйоднозамещенный 0,3 Сернокислый калий 0,03 Сернокислый магний 0,03 Ацетат аммония о 0,6 Смесь микроэлементов, мл/л 1,6 Вода Остальное с рН среды перед посевом 5,3 +0,1 готовят по примеру 1. Питательную среду засевают вегетативным посевным мицелием штамма Взагца вопИИоппе в количестве 5,0-6,0 и выращивают при 281 С, расходе воздуха 75050,0 м /ч и непрерывно работающей мешалке в течение 280-300 ч. Содержание гиббереллинов в культуральной жидкости составляет 3400 мкг/мл, Остаточное содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости 1,4. Фильтруемость культуральной жидкости 85,0+5,0 мл(мин. П р и м е р 3. Приготовление 8,0 м ферментационной питательной среды следующего состава, мас. :Кукурузная мукаЗеленая патокаРапсовый шротАцетат аммонияКалий фосфорнокислыйоднозамещенный 0,08 Сернокислый магний 0,005 Сернокислый калий 0,005 Смесь микроэлементов, мл/л 0,35 Вода Остальное рН 5,0-5,5 ведут по примеру 1, Готовую питательную среду засевают вегетативным посевным мицелием Е.воп 1 Иогве в количестве 5,0-1,0 и выращивают при 28+1 С при непрерывно работающей мешалке и расходе воздуха 750.ф. 50 м /ч в течение 240-280 ч. Содержание гиббереллинов в культуральной жидкости 2600 мкг/мл, остаточное содержание редуцирующих веществ 0,9, фильтруе. мость кул ьтурал ьной жидкости 90.+5 мл/мин.П р и м е р 4. Питательную сред следу- Калий фосфорнокйслыйоднозамещенный 0,07 Сернокислый магний 0,003 Сернокислый калий 0,003 Смесь. микроэлементов, мл/л 0,3 Вода Остальное готовят по примеру 1, Готовую питательную среду засевают вегетативным посевным мицелием Е.воп 1 Иогве в количестве 5,0- 10,0 и выращивают при 28 й 1 С, расходе воздуха 700 м /ч и непрерывно работающей мешалке в течение 240-280 ч. Содержание гиббереллинов в культуральной . жидкости 2000 мкг/мл. Остаточное содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости 0,7. Фильтруемость культуральной жидкости 30,0 й 5 мл/мин,П р и м е р 5. Питательную среду (8,0 мэ) следующего состава, мас. ;Кукурузная мука 8,2 Зеленая патока 17,5 Калий фосфорнокислыйоднозамвщенный 0,4 Сернокислый калий 0,04 Сернокислый магний . 0,004 Ацетат аммония 0,7 Смесь микроэлементов, мл/л 1,6 Вода Остальное рН среды 5 ДМ,1 готовят по примеру 1.Стерильную питательную среду (8,0 мз) засевают вегетативным посевным мицелием Е.воп 1 Иогве в количестве 5,0-6,0 и выращивают при 28.ф.1 С, расхбде воздуха 750 +50,0 м /ч и непрерывно работающей мешалке в течение 280-300 Ующего состава, мас,:Кукурузная мука 5,6Зеленая патока 7,0Рапсовый шрот 0,6Ацетат аммония 0,25 ч, Содержание гиббереллинов в культуральной жидкости составляет 2350 мкг/мл, остаточное содержание общих редуцирующихвеществ в культуральной жидкости 1,8,5 фильтруемость культуральной жидкости24+1 мл/мин, Результаты, полученные впримерах 1-5, приводятся в табл.1.П р и м е р 6, Исследовано влияниезеленой патоки и рапсового шрота на био"0 синтез гиббереллинов культуройЕ.воп 1 Иогве штамма ВНИИгенетика 919,Приготовление питательной среды проводят согласно регламенту, В среду вместоглюкозы вносят расчетное количество куку 15 рузной муки и рапсового шрота при постоянном перемешивании, суспензиюнагревают до 85 С и выдерживают в течение 30 мин. Затем добавляют расчетное количество (60) глюкозы, сернокислого20 калия, сернокислого магния и смеси микроэлементов. Смесь перемешивают в течение15 мин и проверяют показатель рН. Приотклонении его от значений 5,4-6,0 рН доводят раствором едкого натра или ортофос 25 форной кислоты.В другой емкости в водопроводную водувносят расчетное количество аммония азотнокислого, калия фосфорнокислого одноэамещенного и кукурузного экстракта30 (контроль), Водородный показатель соответствовал значениям 4,8-5,2 ед.После стерилизации среды и охлаждения ее до 28 С засевают стерильным посевным материалом в количестве 10 от35 объема питательной среды., Результаты, представленные в табл.3,показывают, что использование рапсовогошрота в известной среде увеличивает выходгиббереллинов до 33,0. Таким образом,40 использование рапсового шрота в питательной среде повышает синтез гиббереллиновне только за счет содержания азота в своемсоставе, но и потому, что рапсовый шротявляется стимулятором биосинтеза,45 П р и м е р 7. Проводили сравнительноеисследование продуктивности разныхштаммов Е,вопИогве - продуцентов гиббереллинов - в зависимости от способакультивирования,50. Для работы использовали культуруЕцзагцв вопИИогве штаммов Р 9-7, Ги и ВНИИгенетика, применявшихся впроизводстве гибберсиба.Питательную среду следующего соста 55 ва,по техническому весу;Кукурузная мука 7,5Зеленая патока 1 1,5Рапсовый шрот 1,4Ацетат аммония 0,4Калий фосфорнокислый1621506 0.,20,020,02 Таблица Сравнительная оценка продуктивности штамма Р.гпопНогае, культивируемого на средах известного и предложенного составовСо е жание компонентов, мас. Способ получения мука ку- курузная калий фосфорнокис лыйглюкоза ацетатаммония серно- кислый магний серно- кислый калий 6,0 6,0 0,2 0,02 0,02 0,2 0,3 0,08 0,07 0,4 1 1,5 16,5 8,0 7,0 17,5 1,4 1,8 0,7 0,6 2,0 7,5 8,0 4,8 5,6 8,2 0,4 0,6 0,28 0,25 0,7 0,02 0,03 0,005 0,003 0,04 0,02 0,03 0,005 0,003 0,04 Продолжение табл. 1 Биохимический анализ культуальной жи костифильтруемость, мл/мин азотнокислый аммоний содержание гиб- береллинов, мкг/мл редуцирующие вещества,смесь микроэлементовкукурузный экс- тракт 240 1,0 21 ОО 0.3 0,6 8,0 0,1 270 280 240 240 290 105 85 90 ЗО 24 1,0 1,5 0,35 0.3 1,6 1,2 1,4 0,9 0,7 1,8 3680 3400 2600 2 ООО 2350 однозамещенныйСернокислый калийСернокислый магнийСмесь микроэлементов,мл/л среды 1,0 Вода Остальное готовят по примеру 1, Питательную среду засевают посевным материалом культуры Г,гпопНогае шт, Ряили Ги, или ВНИИгенетикав количестве 10 от обьема ферментационной среды. Температура культивирования 28+1 С, продолжительность культивирования 270 ч. Результаты ферментации по предлагаемому способу в сравнении с результатами использования Известный Предлагаемый по. примерам1 2 Э 5 Известный П редл а гаемый по примерам1 2 3 4 5 существующего способа представлены втабл,4,Таким образом, предлагаемый способкультивирования Г,гпопИоггпе дает поло 5 жительный эффект при использовании различных штаммов.В табл.5 приводятся сравнительные результаты по получению препарата известным и предлагаемым способами,10 Использование предлагаемого способакультивирования позволяет повысить продуктивность культуры Г.вопЮане на 70, увеличить сьем готового продукта в 1,8 раза, 15 снизить стоимость питательной среды.10 1621506 Таблица 2 Влияние концентрации зеленой патоки на биосинтез гиббереллинов культурой Ецзагйпч топПФоппе шт. ВНИИгенетикаТаблицаЗ Таблиц Сравнительная оценка продуктивности - продуцентов ги лино Та равнительные результаты по наработке препарата известны и предлагаемым способамиВлияние рапсового шрота на продуктивность культуры Гцвагцв вопНИогве шт,ВННИИгенетикана глюкозной среде (прототип).1621506 12 Продолжение табл, 5 СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА ГИББЕРЕЛЛИНОВ - МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА РОЖАВ ОМ МОИ 3 ГОВМЕСпособ культивирования продуцента . гиббереллинов - микроскопического гриба Рнвагна гпоп 11 Ногае - на жидкой 10 питательной среде, содержащей источ,ик углерода в виде кукурузной муки и гл окозы, органический источник азота, соль аммония, однозамещенный калий фссфорнокислый, сернокислый магний, "5 сернокислый калий и водный раствор смеси микроэлементов, включающий,мг/л: сернокислый марганец 80, серно- кислый цинк 3000, сернокислая медь 20 40 О, азотнокислый кобальт 100, борная, кислота 60, оптличаащийсл тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта за счет увеличения синтеза гиббереллинов и скорости фильтрации 25 культуральной жидкости, а также снижеСоставитель Л.МишинаТехред М,Моргентал Корректор М,Самборская Редактор В,Трубченко Заказ 292 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретения ния себестоимости среды, в качестве источника глюкозы в среду вводят зеленую патоку, являющуюся одновременно стимулятором синтеза гиббереллинов, в качестве источника органического азота - рапсовый шрот, а из солей аммония используют ацетат аммония при следующем соотношении компонентов среды, мас.:Кукурузная мука 5,8 - 8,0, Зеленая патока 8,0 - 16,5 Рапсовый шрот 0,7 - 1,8Ацетат аммония 0,28 - 0,6 Калий фосфорнокислый однозамеще нный 008 - 0,3 - Сернокислый магний 0,005 - 0,03,Сернокислый калий 0,005 - 0,03 Водный раствор смеси микроэлементов 0,35 - 1,5 Вода Остальноепри этом процесс культивирования осуществляют до содержания редуцирующих веществ в культуральной жидкости 0,9 - 1,4.