Способ определения l-аминокислот

1386883 5 10 15 Изобретение относится к электро"химическим методам анализа материа"лов, а именно к способу количествен"ного определения Ь"аминокислот путемизмерения тока при электролизе вовремя ферментативных реакций,Целью изобретения является упрощение процесса и повышение селективности определения Ь-аминокислот,На чертеже показана схема измерительной ячейки для осуществления спо. соба.Способ включает электролиз иссле" дуемого вещества в слабощелочном фосфатном буфере с использованием графитного электрода, покрытого мембраной иммобилиэованной оксидазы4 НО+1 Ре (СН)Д + 2 Н перокКоличество добавляемой в мембрану пероксидазы должно быть такиМ, что" бы реакция, катализуемая перок" сидазой по уравнению (1), была быстрой, т.е, не лимитировала общий процесс. Для этого достаточен 10- 50-кратный избыток пероксидазы по сравнению с оксидазой Ь-аминокислот по активности, Выход за верхний предел не требуется и нецелесообразен экономически. Кроме того, при увеличении концентрации фермента увеличивается толщина мембраны, в результате увеличивается ответ электрода и уменьшается его чувствительность,Восстановление образующегося ферроцианида на графитовом электроде при О В приводит к генерации катод- ного тока, величина которого пропорциональна концентрации Ь-аминокислоты.Предлагаемый способ не требует химическо 1 модификации графитного электрода, таким образом упрощается процесс. Повьппение селективности обеспечивается тем, что электролиэ проводится при О В, а при этом потенциале основные электрохимически активные вещества не окисляются и величины фоновых токов при введении проб реальных образцов не превьппают 17,. Поэтому концентрации Ь"аминокислот в реальных средах опре" деляют по калибровочному графику для чистого. раствора.Измерительная ячейка состоит из корпуса 1, изготовленного из орга" Ь-аминокислот, и электрода сравненияиз А 8/А 1 С 1 и измерение тока в ячейке при взаимодействии фермента с суб"стратом, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калияв концентрации 1"2 мМ, в иммобилнзованную мембрану оксидазы Ь"аминокислот дополнительно вводят пероксидазу, а графитный электрод используют без химической модификации, электролиз проводят при О В и концентрацию Ь"аминокислот определяют по увеличению катодного тока.В ферментной мембране, содержащей оксидазу Ь-аминокислот и пероксидазу, кроме окисления Ь-аминокис" лоты, происходит превращение по схеме сидаза 21 Ре(СЮ)Д +2 Н О, (1)нического стекла и содержащего вход"ной и выходной патрубки для промыв"ки и заполнения ячейки буфернымраствором, и измерительной камеры2 с магнитной мешалкой 3, в которуюпомещены рабочий графитный электрод4, покрытый иммобилизованной мем"браной 5 и электрод 6 сравнения из 30 А 8/А 8 С 1 и которая содержит верхнееотверстие для введения пробы. Промывка и заполнение измерительнойкамеры буферным раствором осуществляют при помощи двухканального135 перистальтического насоса, Рабочийи вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем.В измерительную ячейку объемом1 мл, содержащую буферный раствор с 40 ферроцианидом калия, вводят 0,05 млраствора Ь-аминокислоты. При взаимо.действии фермента с субстратом измеряются параметры ячейки. После анализа ячейка промывается 1,5 мин стру ей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.П р и м е р 1. Определение концентрации Ь-лейцина.Для приготовления ферМентной мембраны 3 мг оксидазы Ь-аминокислот,10 мг пероксидазы и 16 мг сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл0,01 М фосфатного буферного растворарН 7,5, О, 1 М КС 1, Смесь обрабатыва ется 5 мкл 5 Х-ного глутарового альдегида и выливается на диализнуюамембрану площадью б см . Высушеннаяпри 4 С мембрана, толщина которой50 мкм, надевается. прямо на графит 1386883Из табл. 3 видно, что ток ячейки зависит от концентрации ферроцианида калия в буферном растворе.При увеличении концентрации медиатора до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрации соединения выше 1 мМ практически не меняется. Таким образом, способ реализуем при концентрации медиатора выше 1 мМ, а с 50 ный электрод и прикрепляется резиновым кольцом.Определение Ь-лейцина при помощиприготовленного ферментного электрода проводят в 0,01 М фосфатном бу 5фере рН 7,5, содержащем 0,1 М КС 1и 2 мМ ферроцианида калия, потенциалграфитного электрода 0,0 В относительно А/АдС 1 электрода.10Данные изменения катодного токапри изменении концентрации добавленного Ь-лейцина приведены в табл. 1.Из табл, 1 видно, что прямолинейность калибровочного графика наблюдается до 0,8 мМ Ь-лейцина.П р и м е р 2, Определение концентрации различных аминокислот.Ферментная мембрана и ферментныйэлектрод изготавливаются аналогичнопримеру 1, Определяется ток в буферном растворе, содержащем разные аминокислоты; 0,01 М фосфатный буферрН 8,0, 0,1 М КС 1, концентрация ферроцианида калия 1,5 мМ, концентрация аминокислот 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 1.Результаты представлены в табл. 2.Из табл, 2 видно, что наилучшимсубстратом для оксидазы Ь-аминокис 30лот является Ь-лейцин, однако можноопределять и Ь-метионин, Ь-Я-фенилаланин, Ь-триптофан, Ь-изолейцин,Ь-аргинин. П-Аминокислоты, Ь-алании,Ь"аспарагин, Ь-треонин и Ь-пролинпрактически не мешают определению.П р и м е р 3. Определение зависимости тока ячейки от концентрацииферроцианида калия и рН буферногораствора.Каталитическая мембрана и ферментный электрод изготовлены, как в примере 1, Определяется концентрацияЬ-лейцина в зависимости от концентра"ции ферроцианида калия в фуберном45растворе рН 7,8, концентрация Ь-лейцина 1,0 мМ, Условия определения,как в примере 1,Данные приведены з табл. 3. целью экономии реагента оптимальнаяконцентрация 1 мМ,Показания электрода зависят отрН буферного раствора. Так, при наличии в ячейке 0,6 мМ Ь-лейцина прирН 6,0 ток ячейки 390 нА, при рН6,5 - 450 нА, при рН 70 - 485 нА,при рН 7,5 - 480 нА, при рН 8,0482 нА, при рН 8,5 - 465 нА, прирН 9,0 - 436 нА, Таким образом, интервал рН 7-8 является оптимальным.П р и м е р 4. Определение концентрации Ь-лейцина в средах выращивания микроорганизмов,Каталитическая мембрана изготовлена, как в примере 1. Среды длявыращивания микроорганизмов приготовлены путем растворения соответствующих количеств Ь-лейцина в культуральных средах. Измерения проводятся, как для чистых растворов, концентрация Ь-лейцина определяется покалибровочному графику для чистыхрастворов, Условия определения,как в примере 1.Данные измерений представлены втабл, 4,Из табл. 4 видно, что точностьопределения (т,е. коэффициент вариации) не превышает ЗХ. Остаточныйток в средах не превьппает 0,5-1,0 Е,так как вещества, находящиеся в реальных растворах, являются электрохимически неактивными при нулевомпотенциале графитного электрода.П р и м е р 5, Определение стабильности электрода во времени.Ферментный электрод изготовлен,как в примере 1. Концентрация Ь-лейцина 0,5 мМ. Условия определения,как в примере 2.Результаты зависимости тока отпродолжительности сохранения электрода представлены в табл. 5,Из табл, 5 видно, что работоспособность электрода сохраняется втечение 2 мес.По сравнению,с известным предлагаемый способ определения Ь-аминокислот является более простым, экспрессивным и селективным, так какотсутствуют операции предварительной обработки образцов, химическоймодификации электрода и определениявлияния других веществ, которые на"ходятся в биологических реальныхсредах. Быстрота анализа особенноважна в микробиологической промыш1386883 ленности при непрерывном контролеуровня Ь аминокислот. Таблица 1 Концентрация О, 12 О, 24 О, 36 0,48 О, 60 О, 80 1,0 1, 5Ь-лейцина,мМ,81 0,81 82 73 0 1 0,36 0,55 О,бб ок, м формула изобретения5 Способ определения Ь-аминокислот, включающий электролиз исследуемого вещества в буферном растворе с использованием графитового электрода- покрытого мембраной иммобилизованной оксидазы Ь-аминокислот, и электрода сравнения из А/А 8 С 1 с последующим определением концентрации Ь-аминокислот по увеличению тока, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повыщения селективности, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1 "2 мМ, в иммобилизованную мембрану оксидазы Ь"аминокислот дополнительно вводят пероксидазу, при этом электролиз ве" дут при нулевом потенциале относительно электрода сравнения.1386883 Таблица 4 Концентрация Ь-лейцина,мМ Ср сновныеомпоненть Найдено Взято 50+0,026 0,25 0,250 ф 0,006 0,50 0,495 ф 0,012 Оф 75 Ов 745+0,20 0,25 0,249+0,006 0,50 0,501+0,010 0,75 0,752+0,023 КС 1,РеЯОза, глю" дрожжевой ктК,НРО 4 ЮаИО 1, мальто Среда для выращивания В. эцЪС 1 дз коза экст КНОлюкозаа Среда для выращивания Рзецйоочев 2 вблвца йолмчеетеодвей дейстзй зйбйффТКЩФ 6 8 42 4 19 2 472 4 О 365 Й 15 330130 320+10 220 145 13430 26 125 23 Среда для выращи- КН РО, (ИН ) , 0,25 0,251+0,00вания дрожжей БО, М 8804,глюкоза, вода 0,50 0,505+0,0138 б 883 Составитель В. ВарлаТехред Л. Олийнык вКорректа едактор О. Юркове оши аказ 490 4 го кий и по 13035, 4/ ская венно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 оизв Тираж, 84 Государствен лам изобрете сква, Ж,Подписноеитета СССРкрытий