Способ определения серотонина в клетках нервной ткани на гистологическом препарате

(1 Е (11) ГОСУДАРСТВЕННЮ КОМИТЕТ СССРПО ДВЛМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОН АВТОРСКОМУ СВИДЕТВЪС БРЕТЕНИ Н 6.1., (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНИНА В КЛЕТКАХ НЕРВНОЙ ТКАНИ НАГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ путем еезамораживания,.приготовления срезов,высушивания ц облучения световымпотоком с последующим определениемсеротонина по интенсивности свечения, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения. точностиспособа, высушивание проводят при40-60 С в течение 10-5 мин, а дляоблучения используют мощность свето 7. вого потока 6 10 - 1210,Флоур и мед(71) Кишиневский ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйствен ный институт им. М. В. Фрунзе (72) В. С. ЛутанИзобретение относится кмедицине.Пелью изобретения является повышение точности способа.Способ осуществляют следующимобразом,Свежую ткань замораживают в криостате и готовят из нее срезы толщиной до 25 мкм. Срезы помещают напредметные стекла, высушивают в струетеплого воздуха при чОС в тейчение 10-15 мин, и помещают под люминесцентный микроскоп, где облучают световым потоком мощностью в 61 -12 . Сравнивают Флуоресценцию иссле 10дуемых клеток с контролем, и по соотношению судят об изменении в нихсодержания серотонина. При этом серотонин испускает собственную Флуоресценцию, достаточную для визуальногонаблюдения, регистрации и ФотограФирования. Соотношение Флуоресценции различных клеток между собой и сконтролем является мерой сравнительной количественной оценки изменениясодержания в них серотонина. То обстоятельство, что при этом регистрируется свечение самого искомого вещества (серотонина), а не продуктаего химической реакции с параформальдегидом, обеспечивает достоверностьрезультатов и правомерность сравне -ния данных,. полученных в различныхопытах и с контролем, При использовании в качестве эталонов различныхконцентраций серотонина возможенперевод условных единиц Флоуресценции в абсолютные единицы массы вещества,П р и м е р 1. 10 интактных крысвесом 130-150 г обезглавили в состоянии эфирного наркоза. Дляисследования отобрали область четверохолмия среднего мозга, которуюйзаморозили в криостате при - 10 С.Из нее приготовили серийные срезытолщиной 15 мкм, которые установилина предметные стекла и высушили вструе теплого воздуха при 50 С втечение 5 мин.Для выявления серотонина срезымозга облучили светом в люминесцентном микроскопе 3 ЭИАМ-И. Источником света служила лампа ДРШ,при этом мощность светового потока,падающего на срез мозга, при мощности светофильтров возбужденияФСразной толщины и апертурнойдиафрагмой микроскопа установили равным 310. Изучение спектральныххарактеристик свечения нервных клеток проводили при помощи фотометрической приставки ФМЗЛА. Ею же измеряли интенсивность свечениянервных клеток, Для этого в качествезонда испольэовалй полевую диафрагму микроскопа. Из обшего значенияФлоуресценции нервных клеток вычитали значение неспецифической Флуо-,ресценции нервной ткани. Таким образом, в расчет брали только свечение, вызванное серотонином клеток(так как исследовались группы однородных клеток, то их размер не влиялна содержание серотонина в них).В срезах среднего мозга, в вентральных и дорэальных областях,выявили клетки, содержащие флуоресцирующую зерностость, которая занимает все тело клетки, преимущественно в местах отхождения аксона и дендритов. Ядро клетки не флуоресцирует. Зерна светятся желтым или желто оранжевым светом, а их количествои интенсивность свечения неодинаковы в различных клетках. В частности, в среднем мозге выявляютсядве группы клеток - ярко и слабоФлуоресцирующие. Доказательствомтого что обнаруживаемое свечениегранул нервных клеток обусловленоименно содержащимся в них серотонином, является видимый желтый светФлуоресценции, максимум которой лежит в области 520-550 мкм. Специфическим для серотонина являетсятакже увеличение интенсивности послеприменения ниаламида и уменьшениепосле дачи животным резерпина, Дру 4 Огие амины, например катехоламины,гистамин, не обладают собственнойФлуоресценцией и не мешают определению серотонина.Облученные световым потоком мощностью в 310 клетки вентральныхобластей среднего мозга (ярко фсуоресцирующие) показывают среднеесвечение, равное 7,0+0,3 усл. ед./клетку, а нейроны дорзальных областейсреднего мозга (слабо Флуоресцирующие) - 2,6+0,2 усл. ед./клетку, отношение яркости свечения обеих групп клеток составляет 2,6.П р и м е р 2. 1 О интактных белых лабораторных крыс обезглавилипод эфирным наркозом, быстро извлекли мозг, который заморозили в криостате при температуре -1 О С. ИзТаблица 1. Интенсивность свечения клеток, усл.ед./клетку Мощностьсветовогопотока А. Ярко флуоресцирующне клет- ки Б. Слабо флуоресцирующие клет- ки Зщ 2,6+0,2 5,6+0,6 8,2+1,6 7,0+О,З 2,6 1,6+0,8 6 9 16,6+1,6 22,3+.1,2 15,+1,1 1,92 11,0+1,2 1210 2,02 14 10) 3+0,9 тех же областей среднего мозга готовили серийные срезы толщиной 15 мкм, которые устанавливались на предметные стекла и высушивались в струе теплого воздуха с температурой 50 С в течение 15 мин. Срезы изучались в люминесцентном микроскопе при условиях, описанных вьппе, за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной 6 ф.Среднее свечение ярко фпуоресцирующих клеток составляет 11,6 + +0,8 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирующих - 6,6+0,6 усл.ед./клетку, а отношение яркости свечения обеих групп клеток равняется 2,07.П р и м е р 3. У 1 О интактных белых лабораторных крыс получали срезы среднего мозга описанным способом, которые обрабатывали и изучали в люминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере 1 за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной 9. При такомосвещении сильно фпуоресцирующие клетки среднего мозга показывали свечение, равное 6,16+1,6 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирующие - 8,2+1,6 усл.ед,/ клетку, а отношение свечения обеих групп клеток равнялось 1,92.П р и м е р 4, У. 10 интактных лабораторных крыс получали описанКак видно из табл. 1, слабо фпуоресцирующие клетки среднего мозга могут быть выявлены только при применении мощности светового пото 193497 4ным способом срезы среднего мозга,которые обрабатывали и изучали влюминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере 1, заисключением того, что мощность облучающего светового потока устанавлиювалась равной 12 При такой мощности светового потока сильно флуоресцирующие клетки показываютО среднее свечение, равное 22,3++1,2 усл. ед./клетку; слабо флуоресцирующие - 11,0+1,2 усл.ед/клетку,а отношение свечения обеих группклеток равно 2,02,5 П р и м е р 5. Срезы среднегомозга 10 интактных белых лабораторных крыс получали, обрабатывалии изучали в люминесцентиом микроскопе при услОвиях, описанных в примере 1, за исключением того, чтомощность облучающего светового потока устанавливалась равной 14.В таком световом потоке сильно флуоресцирующие клетки показывали свечение 5,+1,1 усл.ед./клетку, слабо флуоресцирующие - 10,3+0,9 усл.ед/клетку, соотношение между свечениемобеих групп клеток составляло 1,5. Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток среднего мозга при облучении ик светом различной силы приведена в табл . 1. 55 ка не слабее 3 ф. Световой поток мощностью менее 3 "фне выявляет все серотонинсодержащие клетки мозга и не может применяться для их ана 5 11лиза. С увеличением мощности светового потока интенсивность флуоресценции обеих групп клеток мозга возрастает, однако. только в интервалеот б"о до 12" интенсивность флуоресценции возрастает линейно в зависимости от мощности светового потока.В этом интервале соотношение флуоресценции двух групп клеток, содержащих различное количество серотонина, сохраняется равным приблизительно двум,1 оПоток света мощностью более 12например 14, уменьшает флуоресцен 1 оцию из-за усиленного разрушения серотонина светом, и не может применяться для его анализа, Следовательно,для анализа серотонинсодержащихклеток может применяться световойпоток мощностью от 3"о до 12П р и м е р 6. Срезы среднего"мозга получали от 10 белых интактных крыс способом, описанным впримере 1. Срезы устанавливались напредметные стекла и высушивалисьв струе воздуха с. температурой 20,40, 50, 60 и 80 С. Исследованияпоказали, что высушивание срезовпри 20 С требует больше времени,чем при использовании воздуха с температурой 50 С,Изменение сроков высушивания является нежелательным, так как приэтом в нервных клетках происходятопределенные химические превращения,влияющие на содержание в них серотонина, Поэтому такая температура неможет применяться для анализа серото 93497 ЬП р и м е р 8. Сравнение точностиизвестного и предлагаемого способаисследования серотонина. Мозг 10белых лабораторных интактных крысзамораживали в криостате при темпе 5оратуре -10 С и из области дорзального ядра шва среднего мозга готовили серийные срезы толщиной 20 мкм.Срезы нумеровались от 1 до 20 ио наклеивались на отдельные предметныестекла. Таким образом, каждый срезсодержал клетки одной популяции -дорзального ядра шва с одинаковымсодержанием в них серотонина, В15 дальнейшем 10 срезов обрабатывалисуществующим гистохимическим методомвыявления серотонина, а 10 среэов -предлагаемым способом. Это дает возможность выявить влияние условий реакции на результаты определения серотонина, На конечном этапе во всехсрезах определяли интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток,как описано в примере 3,Полученные результаты обрабатывали статистически с вычислениемсредней арифметической (М), среднеквадратического отклонения ( 6),дисперсионного отношения (Уц) икритических значений параметра дляуровней значимости Я0,01 и 0 (0,05по таблицам Фишера.Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток в срезах мозга,обработанных предлагаемым способом16,0 5 О 3 17,2 15,3 559 17,1 10 14,2 2 нина,Температура 80 С вызывает денаотурацию нервных клеток, искажение ихструктуры, и поэтому такое значениетемпературы также не может применяться для анализа серотонина. Следовательно, оптимальным является4высушиванием срезов воздухом с температурой 40-60 оС.П р и м е р7, Срезы среднегомозга 1 О интактных белых крыс .полу-чали, как описано в примере 1. Срезы устанавливались на предметноестекло и высушивались в струе воздуха с температурой 50 С в течение5,10,15 и 25 мин, Исследования показали, что полное высушивание срезовнаступает через 15 мин. Высушиваниев течение 5 мин не обеспечивает пол-,ного обезвоживания срезов, а 25 минявляются избыточными. Интенсивность флуоресценции (усл.ед.)25,316,024,219,118,322,17 1193497 Продолжение табл.2 нит ельного количества определениясеротонина в клетках и оценки изменения его содержания при различных болезнях по сравнению с контрольными, здоровыми животными, изучена на крысах с различным уровнемсеротонина в клетках, вызываннымрезерпином и ниаламидом. В качествеконтроля использованы здоровые ин тактные крысы с нормальным содержанием серотонина в клетках мозга.Так как резерпин приводит к исчезновению серотонина в слабо флуоресцирующих клетках, то в этих опытах 15 изучались только ярко флуоресцирующие серотонинсодержащие клетки,уровень амина в которых лишь значительно снижается резерпином.Мозг интактиых крыс, а также жи вотных, получивших реэерпин и ниаламид, извлекался после декапиляцииживотных, замораживался в криостатейпри температуре - 10 С, и изготавливали срезы толщиной 15 мкм. Последние устанавливали на предметныестекла и высушивали в струе воздуха, с темгературой 50 С в течение 15 мин.Содержание серотонина в нейронахнаследовали в люминесцентном микроскопе, как описано в примере 1, примощности светового потока 91 ОИнтенсивность флуоресценции серотонинсодержащих клеток в зависимостиот содержания серотонина представлена в табл. 3 14 17,6 15,8 13 15 16 20,5 16,4 18 19,7 17 16,1 15,9 20 17,2 М 16,07 М 20,0 0,49 8,4 Так как дисперсионное отношение 25 (Р 1117,1)больше критических значений параметра по таблице Фишера(5, 37 и 2,7), то различие в дисперсии рядов является существенным и определяется недостаточной точ- З 0 ностью известного метода определения серотонина по сравнению с предлаг аемым.П р и м е р 9. Возможностьприменения данного способа для сравТаблица 3. Крысы, получившие ниаКрысы, получившие резерпин Интактныекрысы(контроль) Показатели ламид Интенсивностьсвечения,усл.ед./клетку 22,3+1,2 13,99+0,7650,88+5,3 Отношение к контролю, Х 62,7 228,1 0,01 0,01 0,01 Примечание. Приведенные в табл. 2 значения интенсивности флуоресценции серотонинсодержащих клетокпредставляют собой среднийрезультат измерения 15 клеток в каждом срезе. Полученные данные показывают, чтопредлагаемый способ пригоден длсравнительного количества определения серотонинав клетках, так как улавливают сдвиги в содержании вещества,вызванные фармакологическимипрепаратами,10 1193497 Составитель В. ГоловинРедактор П. Коссей Техред О.Неце Корректор Е, Рошко Заказ 7306/43 Тираж 896 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 9Использование данного способа обеспечивает по сравнению с известными большую точность определения сдвигов в содержании серотонина в клетке,. так как за основу берется собственная флуоресценция серотонина, а не продукта его химическойконденсации с параформальдегидом,при этом точность определения повышается на 10-153.