Способ получения 5-или-3-фосфодиэфиров моно-или олигонуклеотидов

(56) 1. Гринева Н.И., Сайкович Е.Г.Метоксисульфонилэтиловые эфиры олигонуклеотидов - новые реагенты для метилирования нуклеиновых кислот вкомплементарных комплексах. - "Биоорганическая химия", Т. 5, 1979, й 4,с. 563-567.2, БЬишуапгзеча Ч.Ч., Зо 1 со 1 оча Я,ЮЯЬа 1 агоча Е. А. МоддЕ 1.сайдоп ой епйрЬозрЬае ягоцрз хп шопо апй о 1 дяоппс 1 еог.хдев. Иис 1. Асде 1 з Вез., ч, 3,У 4, р. 903-916, 1965.3. РопязО., ЬапЕа Е, СЬеш 1.са 11 уКеасйже 01 х 8 опис 1 еог,Иез. Тп: МегЬодв дп Епвушо 1 ояу (Ласо 1 у Ъ 7.В.,У 1 сЬе 1 с М. ед., Иед-чог 1 с-Ьопдоп),.1977, ч, 46, р. 669-676,4. БшдгЬ М., КЬогапа Н.С. Ргерагайоп оЕ Иис 1 еоСЫез апй 0 егжай 1 чевТп; МеЬойв п Епвушо 1 ояу (Б.Р., Кар 1 ап Я.О, ей Кем-Той-Ьопс 1 оп), 1963,ч.6, р. 645-669 (прототип). ЯО 11212(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5-ИЛИ 3- ФОСФОДИЭФИРОВ МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ путем конденсации нуклеотидного компонента со спиртом в раство рителе в присутствии производного карбодиимида, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения пр цесса и увеличения выхода целевого продукта, процесс осуществляют в во ной среде, используя в качестве нуклеотидного компонента водораствори мые соли моно- или олигонуклеотидов и в качестве производного карбодиим да 1-этил(3-диметиламинопропил)ка бодиимид.11212 Изобретение относится к усовершенствованному способу получения фосфодиэфиров 1 моно- или олигонуклеотидов, которые используются в биоорганической химии и молекулярной биологии для 5 аффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и мембран, в энзимологни для выделения и изучения субстрат" ной специфичности Ферментов нуклеинового обмена, в медицине для направ ленного воздействия на генетический аппарат клетки.Известно несколько способов получения фосфодиэфиров моно- и олигонуклеотидов, однако имеющиеся спосо бы сложны, ниэкоэффективны и непригодны для работы с микроколичествами дорогостоящего олигонуклеотидного ма" териала.Известен, например, способ получе ния 5 -фосфодиэфиров рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидов с помощью дифенилхлорфосфата, согласно которому получение Фосфодиэфиров проводят в две стадии; сначала из три-/1,-алкиламмониевой соли олигонуклеотида при действии дифенилхлорфосфата в безводном диметилформампде получают активированный пирофосфат олигонуклеотида, затем при действии спирта в безводном ди- ,50 метилформамиде в течение 17-24 ч по. лучают необходимый фосфордиэфир. Выход Фосфордиэфиров олигонуклеотидов составляет 18-25 Х 13.Низкая эффективность метода объяс"35 няется наличием побочных процессов - расщепления олигонуклеотидов и изомеризации в случае рибо- олигонуклеотидов. Кроме того, перевод олигонуклеотидов сначала в три- и -алкиламмо ниевые, а затем обратно в водораство" римые соли осложняет осуществление процесса и снижает выход целевых соединений.Известен способ получения фосфор диэфиров через смешанные ангидриды с мезитиленкарбоновой кислотой, который также включает две стадии: получение смешанного ангидрида при действии хлорангидрида мезитиленкарбоновой кислоты на моно- или олигонукле-отид в безводном пиридине, получение целевого фосфордиэфира в пиридине при взаимодействиии смешанного ангидрида с безводным спиртом 1.21. 55Недостатком этого способа является необходимость перевода моно- и олигонуклеотидов в форму, раствори 66гмую в органических растворителях,поскольку обе стадии процесса проводятся в безводной среде, а такжебольшая длительность процесса от2-4 сут, Существенным недостаткомспособа является также резкое уменьшение выходов фосфодиэфиров при увеличении длины длигодезоксирйбонуклеотида. Так, если в случае фосфордиэфиров мононуклеотидов выходы составляют в среднем 803 (в некоторых случаях 50-603), то уже в случае динуклеотидов выходы соответствующих Фосфордиэфиров падают до 60 , Для получения фосфодиэфиров олигонуклеотидоврибо-ряда способ непригоден, так какпри действии хлорангидрида меэитиленкарбоновой кислоты на олигорибонуклеотид происходит расщепление и изомеризация межнуклеотидных связей.Известен способ получения Фосфордиэфиров олигонуклеотидов с применением фермента - полинуклеотидфосфорилазы, который состоит в том, чтоФосфордиэфир получают на мононуклеотиде и затем проводят наращиваниеолигонуклеотида ферментативным путем.Уже на первой стадии процесса при получении и -нитрофенилового эфира мононуклеотида в безводном пиридине придействии дициклогексилкарбодиимидав течение 8 сут, выход составляет20-507. После проведения ферментативных стадий процесса выход целевогофосфордиэфира олигонуклеотида не превышает 107 3 3,Недостатками данного способа являются низкая эффективность, необходимость использования большого числадорогостоящих Ферментов и невозможность получения таким путем фосфодиэфиров олигонуклеотидов дезокси-ряда.Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности является способ получения 3 - или 5 -Фосфодиэфиров моно- или олигонуклеотидов, вчастности 4-нитрофениладенозин 5 фосфата, 4-нитрофениладенилил-5 -гуанозин-Фосфата, 4-нитрофениладенилил"3 -5 -гуанилил-5-тими 1дин-фосфата, заключающийся в конденсации нуклеотидного компонентаз 1121 гексилкарбодиимида), Выходы целевых продуктов 50-707., Время процесса 2-8 сут. При получении метиловых эфиров мононуклеотидов и коротких 2-4- звенных олигодезоксирибонуклеотидов в безводном метаноле выходы фосфодиэфиров составляют 80-907 за 2 сут 1.Недостатками указанного способа, являются резкое уменьшение выхода фосфодиэфиров олигонуклеотидов при1 О увеличении длины олигонуклеотидной цепи в результате параллельно проте- кающих процессов модификации нуклеодитного материала, которые приводят к необратимым потерям и деградации олигонукл отидов, необходимость5 проведения процесса в безводном органическом растворителе, что связано с трудоемкой и низкоэффективной операцией перевода нуклеотидного материала сначала в три- и -алкиламмони 20 евую форму, а по окончании процесс - обратно в водорастворимую форму.Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения 5 -(или 3 - фосфодиэфиров моно- или оли гонуклеотидов, конденсацию нуклеотидного компонента со спиртом осуществляют в водной среде в присутствии производного карбодиимида, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли моно- и олигонуклеотидов и в качестве производного 35 карбодиимида 1-этил-З-(З-диметилами-, нопропил)карбодиимид.Выход целевых продуктов составляет 80-1007, Время процесса 1-20 ч в зависимости от природы спирта. 40Преимущества предлагаемого способа состоят в использовании в качестве конденсирующего агента водорастворимого карбодиимида, что позволяет проводить процесс в воде и работать с 45 водорастворимыми солями олигонуклеотидов. В результате этого отпадает необходимость дважды переводить олигонуклеотид из одной формы в другую, при этом исключаются неизбежные ранее 50 трудноконтролируемые потери дорогостоящего нуклеотидного материала и впервые появляется возможность работать с микроколичествами олигонуклеотидов, РНК и ДНК. 55Кроме того, способ позволяет высокоэффективно получать фосфоэфиры моно- и олигонуклеотидов любой длины 266 4 й состава избирательного по концевымфосфатным группам, так как в воднойсреде не протекает никаких побочныхпроцессов, связанных с модификациейгетероциклическчх оснований, межнуклеотидных фосфатных групп и изомеризацией и расщеплением фосфодиэфирных связей.Предлагаемый способ позволяет получать фосфодиэфиры моно- или олигонуклеотидов со спиртами различнойприроды - фенолами, алифатическими,аралифатическими и многоатомнымиспиртами, т.е. является более общимпо сравнению с известным.Преимуществом предлагаемого способа является также простота проведения процесса и простота выделенияполученных соединений, поскольку исключаются такие операции, как экстракция, высаживание, неизбежно приводящие к некоторым потерям дорогостоящего нуклеотидного материала,П р и м е р 1. КЯа-соли йрТ(10 ОЕ 20, 1 мкмоль, коммерческийпрепарат в виде порошка) добавляют100 мкл 4 И водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль)1-этил(3-диметиламино-пропил) карбодиимида. Через 0,5 ч при 20 С полученную смесь фракционируют с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 И триэтиламмонийном буфере с рН 7,5-8,0(фиг. 1), Выход метилового эфира дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Соответствующие фосфодиэфиры йрТ с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике,П р и м е р 2. Водный раствор й(рТСТАС) в виде МН -соли (1 ОЕ 4.Моф 0,02 мкмоль) упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил(3-диметиламинопропил) карбодиимида. Выдерживают смесь в течение1,5 ч при 20 С и затем иетиловый эфирпентануклеотида вьщеляют колоночнойанионообменной хроматографией с выходом 957 (фиг, 2). фосфодиэфиры пентануклеотида с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике.П р и м е р 3. Водный раствор (РА)1 в виде На-соли (2 ОЕ О, 0,02 мк-моль) упаривают до масла и добавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг1121266 пропил)карбодиимида. Выдерживают смесь 2 ч при 20 С и полученный метиловый эфир гептадениловой кислоты выделяют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 973 (фиг.З). ЗФосфодиэфиры (рА)т с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной метбдике.П р и м е р 4. Водный раствор й(ТССССААССТр) в виде ЯН -солиФ(1 ОЕ 0,01 мкмоль) упаривают до Выход фосфодиэира,Спир ч0,5 йр(рА)р 0002 Метиловый илов Этиленгликол Моно- или олигонуклеотид ЭтиленгликолЬ -НитрофеноМетиловыйЭтиловый масла и дооавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-З(З-, диметиламинопропил) карбодиимида. Выдерживают смесь 2,5 ч при 20 С и полученный метиловый эфир декануклеотида вьщеляют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 90 Е (фиг. 4).Фосфодиэфиры декануклеотйда с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике. Концентрация Времянуклеотида, И процесса11121266 Миг. 4 Составитель Ю. ГоловаРедактор А. Гулько Техред С.Мигунова Корректор С. Ч ЛПП "Патен ужгород, ул. Проектн ил каэ 7884/17 ВНИИА по д 113035, Тираж 380Государственноглам иэобретенийосква, ЖРа Ю ГРРХагм элювмта, дел Подписиомитета СССРоткрытий.кая наб., д. 4/