Способ получения -аминокислот

(61) Дополнительный к патент (22) Заявлено 140580 (21) (23) Приоритет -. (32) 51) М, Кл,101/00 С 12 Р 13/04, 19350/23 505.79анция Гос 1) 7912285(33) Опубликовано 23.1282, ствеииый комит СССР аи нзобретеин открытий53) УИК 547.466. . 07 (088.8) юллетеньЩ 47 я .2 Ы 282 а опубликования апис Иностра нцы Клод Жиллонье и Марсель Гиварш2) Авторы изобретен к Э.Биоложик" Иностранная фирмЦ. Сосьете де Шими Орг (Франция) 71) Заявитель 54 ) спОсОБ, пОлучениЯО -ОКИСЛОТ указанная цель д ;что согласно способ :-аминокислот выаеук ,мулы (1), где й -ное значение, микро ролиэом гидантоина остигается тем, у получения О.Ыазанной общей фо имеет вышеуказанбиологическим .ги общей формулы ( Изобретение относится к усов нствованному способу получени с(.-аминокислот. общей формулй ( ООК ые значенияьецдоаопаз обраэовавеляют хрой смоле в изоэлектставспособаосуществоаопа а вр.предлагаеительноепродуктов тся повышеов. изобретения явл а целевых проду Цел ие выхгде К-метилмеркаптоэтильная, фенильная бензильная, 2-метилпропильная, пропильная, индолилметильная,4-оксифенильная, 3-оксифенильная или3-цианопропильная группы, использующихся в фармацевтической промышленности,Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ получения природныхО-с(,-аминокислот микробиологическимгидролнзом соответствующих гидантоинов с помощью микроорганизмов, напри"мер,.Рееодоаопаэ ао 1 апасеагоа А 111149, Рьецдоаопав сагуорЬ 1111А 3 11150. Выходы целевых продуктовсоставляют в среднем 20 11.Недостатком известного способа уявляется низкий выход целевых продуктов. С- ЯК1Е 1 11где 11 - имеет вышеуказаннс помощью микроорганизма РЗр НМ(СВЬ 259.79) ишуюся О"о-аминокислоту выдматографией на ионообменноОоиех - 50 или осаждениемрической точке.Выходы целевых продуктовляют 80-92,5,Отличием предлагаемогоявляется то, что гидролизляют микроорганизмом РаеодНМ (СВ 259.79).Положительным эффектоммого способа является эначувеличение выхода целевыхр 20 до 80-92,5.10 После умеренного перемешивания в течение 24 ч весь гидантоин переходит в раствор,Реакционную смесь осветляют цент рифугированием, затем пропускают через ионообменную смолу (смола Оохех 50, Форма Н 4), элюируя 2 н, раствором аммиака. Щелочные фракции упаривают досуха. Получают 3, 98 г О-фенилалани- б 5 П р и м е р 1. а. Получение ферментной композиции.Готовят культуральную среду следующего состава, г/л:Глюкоза 20Одноэамещенный фос- .5фат калия 3Двузамещенныйфосфат калия 7Сульфат магния 0,7Сульфат марганца О, 02.Сульфат железа (1) О, 02Хлорид натрия 1Гидантоин О,-метионина 3Среду разливают в склянки емкостью 1. 15,250 см из расчета 50 см на склянкузИ стерилизуют в течение 15 минпритемпературе 120 С. После посева штамома Рэецдоаопаэ:Бр.НМ) на избирательной среде с агаром склянки перемещивают (250 об/мин) в течение48 ч при температуре 30 оС.Продуктивное выращивание осуществляют в Ферментере емкостью 2 л, содержащем 1 л вышеуказанной культуральной среды и 1 см противопенногоагента. Засевают склянки штаммом,приготовленным как указано выше,Культуру выращивают при температуре30 С в течение 48 ч при перемешивании турбинной мешалкой (скоростьвращения 500 об/мин) и при аэрациистерильным воздухом с расходом1 л/минК концу роста клеточную массуотделяют центрифугированием и суспендируют в 50 см дистиллированнойводы. Данная суспензия содержит 7,6 гсухого экстракта на 100 смв. Гидролиз О,-фенилаланингидантоина.40К 200 см дистиллированной водыдобавляют 5 г О,-фенилаланингидантоина. Нагревают с целью частичногорастворения гидантоина, затем средуохлаждают до 37 С. Доводят рН до 457,8 путем добавления 1 н. раствораедкого натра. После этого добавляют25 смэ клеточной суспензии, полученной раньше. Доводят объем реакционной смеси до 250 см , а рН доводят 50до 7,8,Реакционную смесь помещают в атмосферу азота, поддерживают температуру 37 С, поддерживают рН 7,8 путем постепенного добавления 1 н.раствора едкого натра. на (выход 92,5) со следующимисвойствами.2.0с 3 р = 29,2 + 2 (с = 1, вода)й= 8,63 (по теории 8,48)Потенциометрическое титрование: 93,3.Оптическая чистота полученного О-фенилаланина превышает 93.П р и м е р 2. К 150 см дистиллированной воды добавляют 4 г О- -метионингидантоина и 8 см клеточной суспензии, содержащей 0,6 г сухого экстракта (полученного в условиях, описанных в примере 1),Доводят рН до 7,8 путем добавления 1 н. раствораедкого натра. Объем реакционной смеси доводят до 200 см путем добавления дистиллированной воды. Реакцию проводят в течение 24 ч при температуре 37 С, поддерживая рН = 7,8 путем постепенного добавления 1 н, раствора едкого натра.Содержание О-метионина в реакционной смеси определяют по методу Штейна и Мура: его концентрация составляет 17 г/л, что соответствует 100 превращения в расчете на взятый О,-метионингидантоин.Реакционную смесь осветляют центрифугированием, затем пропускают через ионообменную смолу (смола Ооиех 50, форма Н ); Получают 2,7 г О-метионина (выход 80) со следующими свойствами;то(о(3 р = - 19 3 (с = 1/ 5 н, хлористоводородная кислота)М= 9,36-9,42 (теоретическое: 9, 39)Оп тическая чистота получ е нно го О-метионина близка к 90.П р и м е р 3. а. Получение ферментной композиции.Готовят культуральную среду следующего состава,г/л;Глюкоза 20Дрожжевой экстракт 10Бактопептон 10Среду разливают в склянки емкостью 250 смз из расчета 50 см на склянку и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 120 С. После посева щтамма Рьецдовопаь 5 р. НМсклянки перемешивают (250 об/мин) в течение 24 ч при температуре 30 С.Содержимое одной склянки используют для обсеменения ферментера емкостью 2 л, содержащего 1 л вышеуказанной среды. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре 30 С при перемешивании турбинной мешалкой со скоростью вращения 500 об/мин и аэрацией стерильным воздухом с расходом 1 л/мин.К концу выращивания микробную массу отделяют центрифугированием и суспендируют в 100 смз дистиллированной воды, эта суспензия содержит 8,9 г сухого клеточного экстракта.в, Ферментный гидролиз метионингидантоина.Растворяют 5 г Ометионингидантоина в 200 см дистиллированной во 3ды, Доводят рН до 7,5 путем добавления О, 1 н. раствора, едкого натра, затем добавляют 20 см полученной ранее клеточной суспензии. объем доводят до 250 см 3, реакционную смесь помеща ют в атмосферу азота, температура ре- акционной смеси 37 С.После проведения процесса в течение 5 ч содержание метионина в среде 15 определяют хроматографическим методом по методике Штейна и Мура. Определяют гидантионазную активность клеточной суспензии (количество молей метионина, продуцирова;.ного на 1 мг 20 сухого клеточного экстракта в 1 ч ферментативной реакции) она составляет 4,5.После проведения процесса в тече;ние 22 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием. Образовавшийся метионин отделяют пропусканием через ионообменную смолу (Оочех 50, форма Н ), элюируя 2 н. раствором аммиака,Элюат выпаривают досуха и сушат, получают 3,9 г О-метионина (выход 91) со следующими свойствами:Й= 9,4 (теоретическоесодержание 9,39)10 Цо 23 о (С 1, 5 н хлористоводородная кислота)Потенциометрическое титрование 98.П р и м е р 4, ферментативный гидролиз -оксифенилглицингидантоина, 4 ОГотовят 100 см,суспензии, содержащей 8,9 г сухого клеточного экстракта в условиях, описанных в примере 3 а.Растворяют 5 г 4-оксифенилглицингидрантоина в 250 см дистиллирован 3ной воды. Доводят рН до 7,5 путем добавления 0,1 н.раствора едкого натра и добавляют 20 см 3 клеточной суспензии. Объем доводят до 250 см реакционную смесь помещают в атмосферу азота, температура реакционной смеси 37 С.После проведения процесса в течение 5 ч определяют содержание 4- -оксифенилглицина. Гидантоиназная активность составляет 1,8 М аминокислоты на 1 мг сухого клеточного экстракта в 1 ч протекания ферментативной реакции.После проведения процесса в тече ние 22 ч 4-оксифенилглицин отделяют пропусканием через ионообменную смо" лу (Ооиех 50, форма Н 4), Получают 3,78 г О-(4-оксифенил)-глицина (выход 87), оказавшегося однородным 65при хроматографии, со следующимисвойствами; 30,70,020,021 После протекания процесса в течение 17 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием, упаривают до 1/5 первоначального объема и подкисй= 7,6 (теоретическоесодержание 8,4)ао 135 о (С = 1, 5 н.хлористоводородная кислота)Потенциометрическое титрование110,П р и м е р 5. Выращивают штаммРьецдоюопаь 5 р, НМв следующихусловиях: Состав культуральной среды, г/л:Глюкоза 20Двузамещенныйфосфат калия 7Однозамещенныйфосфат калияСульфат магнияСульфат марганцаСульфат железаХлорид натрия.О-(.-метионингидантоин 3Дрожжевой экстракт 2Предварительное выращивание.Первое предварительное выращивание выполнено в склянке емкостью250 см , содержащей 50 см среды,в течение 24 ч. Второе предварительное выращивание посева, сделанногоиз предыдущей склянки,. осуществленотоже в течение 24 ч в Ферментере емкостью 2.л, содержащем 1 л культуральной среды.Продуцирующая культура,Содержимое двухлитрового ферментера используют для обсемененияФерментера емкостью 7,5 л, содержащего 5 л среды. Культуру выращиваютв течение 24 ч при температуре 37 Спри аэрации .стерильным воздухом срасходом 5 л/мин и перемешиваниитурбинной мешалкой со скоростью500 об/мин.Полученная в таких условиях биомасса составляет 3,8 г сухого экстрак.та на 1 л культуральной среды.Ферментативная реакция.По окончании выращивания микробную массу отделяют от среды центрифугированием и суспендируют в 250 смэдистиллированной воды.Суспендируют 10О,-фенилглицин-,гидантоина в 400 см дистиллированной воды и доводят рН до 7,5 путемдобавления 0,1 н. раствора едкогонатра. Добавляют 50 см вышеописаннойклеточной суспенэии и реакционныйобъем доводят до 500 см добавлением воды. Помещают в атмосферу азотапри температуре 370 С, поддерживаярН = 7,5 в течение 17 н.-глицйн 0,7 15 ляют до рН = 1 путем добавления концентрированной соляной кислоты.Образующийся осадок отделяют фильтрованием и сушат. Хроматографический анализ показывает, что он представляет собой фенилглицингидантоиновую кислоту со следующими свойствами: М= 13,9 (теоретическое содержание 14,4)Ы 3 р = -137 о (с = 1; 1 аммиак)Выход полученной О-.гидантоиновой кислоты 6,3 по отношению к взятому гидантоину,Маточный раствор снова упаривают и доводят до рН = 5 путем добавления едкого натра, выпавший в осадок О- -фенилглицин Отделяют фильтрованием, промывают водой и этиловымспиртом, сушат. Получают 7,6 г О-фенилглицина (выход 88) со следующими свойствами: Й= 9,2 (теоретическое содержание 9,3)го оЫ 3= -148 (С = 1; 5 н. хлористоводородная кислота) 0- 2-фенил -аланингидантоин О-триптофангидантоин П р и м е р 7, По способу, описанному в примере б, получают клеточ ную суспензию Рецдовопав НМв буферном фосфатном растворе. Эта суспензия содержит 6,5 г сухогоРэкстракта в 100 см, перед грименением клетки измельчены ультразвуком при условиях: П р и м е р б. Выращивают культуру Рзецдощопаз бр., НМв условияхпримера 5. После центрифугированиямикробную массу сусйендируют в 0,1 М 5фосфатом буферном растворе при рй7,8, эту суспензиЬ используют в качестве катализатора гидролиза различных гидантоинов, условия реакции следующие:начальная концентрация гидантоина 10 20 г/л в 0,1 М фосфатном буферномрастворе при рН = 7,8;примененная биомасса составляет6,5 г (в расчете на сухой экстракт)на 1 л реакционной смеси," 15 температура реакции 37 оС;продолжительность реакции 5 ч.Затем определяют содержание вреакционной смеси образующейся аминокислоты и по ней вычисляют ферментативную активность клеточного экст"ракта.Вычисленная таким образом активность представлена в таблице в микромолях аминокислоты, образовавшейсяна 1 мг сухого ферментного экстракта в 1 ч реакционного времениРезультаты представлены в табли,це.3 Г Аппарат РОМЯ, оборудованный зондом ТС 4 С60 Частота ультразвука, кГц 20Обработанный объем,Продолжительность65 измельчения, мин 10