Способ получения ферментных препаратов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советски Социалистических Республик-" фут,ависимый К з 6 а 11/04 Заявлено 29 Л 1.1965 ( 10136628-13)с присоединением заявки МПриоритет 1 Г К С 121 сДК 663.11:576.8.093.1(088.8) Комитет по лоламобретений и отнрытик ень чЬ 17 11.1967. Бюлл публиковано и Совете Министров Х 1967 Дата опуоликовация описания вторзобретения Иностранецнике Джин Напиер (Англия)ностранная фирма Лабораториз Лим (Англия) аявитель Гла д) ЕПАРАТ НТН ПОЛУЧЕНИЯ Ф СП вное культивцнезцачительн,замутненность,Известны способы получения ферментных препаратов путем культивирования продуцируюших их микроорганизмов ца питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, например углеводов и минеральных солей, необходимых для роста, при температуре 20 - 35 С в аэробных условиях с последующим выделением ферментных препаратов из биомассы одним из известных способов, например высаливанием сульфатом аммония, адсорбцией, высушивацием культуральной жидкости.Согласно предлагаемому способу получают препараты с высокой активностью, содержащие протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина, в сочетании с ламинариназой, хитиназой, эластазой и липазой, Для этого в качестве продуцирующих микроорганизмов используют бактерии рода Цитофага (Су 1 о 1 ада) КС 1 В 9497.Предлагаемый способ заключается в следующем.Культуру бактерии рода Цитофага (Су 1 о 1 ада) КС 1 В 9497 выращивают ца питательной среде поверхностным способом или глубинным в аэробных условиях.Применяемая культура бактерий имеет следующую характеристику.Морфология. Неподвижные, короткие, прямые палочки, довольно тонкие, стороны параллельны, концы закруглецы, разделены, аиногда спарены между собой. Окрашивают поГраму после выдерживацця на питательномагаре в течение трех дней при 20 С. Грам -5 отрицательные, короткие. прямые палочки спараллельными сторонами, концы закруглены,внешний вид окраски - неровные полоски.Аналогичный внешний вид имеют при выращивании на агаре, содержащем пептон и глю 10 козу. Окрашивапие однородно после культивирования на кровяном агаре,Рост на различных средах. На агаре (четырехдневное культивирование при 20 С) светло-желтые, просвечивают, округлой фор 15 мы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, 1 - 1,5 мм в диаметре, с острым запахом.На агаре, пептоне и глюкозе (четырехдневное культивирование при 20 С) - светло-желтые, просвечивают, округлой формы, выпук 20 лые, полностью гладкие, лоснящиеся, слизеподобны, 1 - 2,5 мм в диаметре, с острым запахом,На кровяном агаре (четырехдневное культивирование при 20 С) - серовато-желтые,25 просвечивают, округлой формы, выпуклые,полностью гладкие, лоснящиеся, 1 - 1,5 мм вдиаметре, с острым запахом.На жидкой среде (двухднерование при 20 С) - рост30 очень слабая неоднороднаяпазпачительное липкое, тягучее н вязкое отложение. Слабый рост отмечался также при30 С.На в 6 де, содержащей пептон (двухдневноекультивирование при 20 и 30 С) - рост незначительный, очень слабая неоднородная замутненность.1-1 а воде, содержащей пептон и глюкозу(двухдневное культивирование при 20 и30 С) - умеренный рост, слабая, неоднородная замутненность,Зависимость между ростом и температурой.При температуре 5 или 10 С роста не наблюдается. Недостаточный рост при 37 С. Отсутствует чувствительность к пенициллину и 15стрептомицину. Чувствительность к хлорамфениколу и гидротетрациклину. Не вызывает образования кислоты или газообразных продуктов в результате воздействия на глюкозу,мальтозу, маннитол или крахмал при 20 илн 2030 С, Отсутствует реакция в среде по Хьюгуи Лейфсону, содержащей глюкозу. Лакмусовое молоко пептонизируется, а и,:- дикатор восстанавливается при 20 С и пептонизируется при 30 С. 5 Келатину разжижает при20 С. Оксидаза,по Коваку положительна при20 и 30 С. Образования индола не происходит,метил-красный отрицателен, ацетометилкарбинол не вырабатывается, аммиак выделяется З 0из пептона при температурах 20 и 30 С, Цитрат утилизируется как источник углерода ввиде золя при 20 и 30 С. Образования липазыили лецитиназы на агаре, содержащем желтоккуриного яйца, не наблюдается при 20 илн 3530 С.Питательные среды, используемые для культивирования, содержат главным образомисточник азота с добавлением в случае необходимости углевода и (или) питательных солей, К числу источников азота относятся солодовый экстракт, мясной экстракт, пептон, замочная жидкость кукурузы или зерна, однако, наиболее пригодным источником азота является мицелий, полученный как отход в производстве антибиотиков. При этом необходимоотметить, что источник азота может полностью удовлетворить потребность выращивасмого организма Цитофага ХС 1 В 9497 в углероде или в других питательных солях без 50их добавления. Так, например, данный микроорганизм сможет развиваться на среде, состоящей только из мясного экстракта и пептона. В некоторых случаях добавление углеводов, например глюкозы, мальтозы, оказывается необходимым,К числу элементов, которые также могутоказаться необходимыми, относятся магний,железо и цинк,Культивируют Цитофагу МС 1 В 9497 прн б 0температуре 20 - 35 С (оптимальной являетсятемпература 26 С), рН среды находится в пределах 5 - 8, предпочтительно 5,5 - 6.Длительность процесса культивирования20 - 50 час. б 5 Образующуюся культуральную жидкостьможно или использовать непосредственно, илиизвлечь из нее ферментный комплекс однимиз известных способов. Так, например, культуральную жидкость высушивают или осветляют (центрифугированием), после чего высушивают (можно методом вымораживания),получая при этом неочищенный препарат.Для получения очищенного препарата производят осаждение последнего ацетоном иливысаливанием сульфатом аммония, или адсорбцией на каолине.Полученный препарат содержит комплексследующих ферментоь: протеазу, ламинариназу, хнтиназу, кератиназу, эластазу и липазу.Зтот комплекс ферментов способен вызыватьраспад мицелия у различных грибковых организмов, например плесени рода Пенициллиуми Цефалоспориум.Способность вызывать распад грибковогомицелия позволяет использовать вышеуказанный комплекс ферментов для уничтожения отходов мицелия после производства антибиотиков, особенно продуктов цефалоспорина,Полученный при этом растворимый материалможет быть использован как питательная среда для проведения последующих процессовферментации. Степень, до которой ферментный комплекс воздействует на грибковый мицелий, зависит от видов мицелия в каждомконкретном случае,Отм:ечалось кератиназное действие комплекса ферментов, который действует, по-видимому, на волосы.Способен разлагать желатину, казеин, воздействовать на кератин, причем действие егопротекает быстро.Данный комплекс можно использовать:в п зоизводстве хлебобулочных изделий;при изготовлении блюд из хлебных злаков(например, овсянка, кукурузные хлопья);для ускоренного созревания мяса с цельюего размягчения;для защиты от охлакдения во время пивоварения;в производстве кормов для животных;в производстве протеиновых гидролизатов;для мягчения крупного кожевенного сырьяи обезволашивания шкур;для удаления пятен по методу сухой чистки;для удаления шлихты с текстильных изделий;в медицине.П р и м е р 1, Конические колбы 250 ил),содержащие по 40 жл следующей среды, (%):мальтоза 4солодовый экстракт 2,4пелтон 1дистиллированная вода - до 100,Водородный показатель рН 7 установлен гидратом окиси натрия. Среду инокулируют с помошью петли культурой микроорганизма. Цитофага 1 Х 1 С 1 В 9497 и инкубируют при температуре 26 С. Содержимое колб перемешива50 55 60 65 ют на аппарате путем возвратно-поступательного движения с амплитудой 5 см, деиствующей при 200 об/мин при температуре окружающей среды 26 С. Через два дня после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к Цефалоспориум акремониум (Бротцу) 1 М 1 - 49137.П р и м е р 2. Конические колбы (250 мл), содержащие 100 мл следующей среды, о/:мясной экстракт 1 пептон 1 хлористый натрий 0,5.Водородный показатель среды устанавливают до значения рН 8 добавлением гидрата скиси натрия, кипятят 1 час, фильтруют, доводят среду до рН 7,2 путем добавления соляной кислоты, инокулируют с помощью петли культурой микроорганизма Цитофага ИС 1 В 9497 и инкубируют при температуре 26 С, Содержимое колб перемешивают на аппарате с возвратно-поступательным движением, с амплитудой 5 см, при 200 об/мин, Спустя один день после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к К, акремониум.П р и м е р 3. 3 л среды следующего состава (стерилизована 30 мин при температуре 120 С), о/,:мицелий К. акремониум, отжатый в сыром виде бкислый фосфорно-кислый калийвторичный 0,07 первичный 0,03сернокислый магний 7 НО 0,05 сернокислое железо 7 Н.О 0,001 сернокислый цинк 7 НО 0,001 глюкоза (стерилизована отдельно) 0,25.Инокулируют 60 мл хорошо разросшейся культуры микроорганизма Цитофага ХС 1 В 9497. Культуру выдерживают при температуре 26 С, перемешивают при 550 об/мин и аэрируют путем пропускания воздуха со скоростью 3 л/мин в течение 20 час, затем следующие 4 час - со скоростью 1 л/мин и в заключение 2 час - со скоростью 0,5 л/мин.Культуру осветляют центрифугированием и всплывшую жидкость лиофизуют. Получают 6,6 г твердого вещества кремовой окраски, обладающего литической активностью по отношению к К. акремониум и протеолитической активностью по отношению к казеину.П р и м е р 4. 1,5 л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, центрифугируют, доводят среду до рН 6,1 добавлением уксусной кислоты и затем концентрируют в вакууме при температуре ниже 40 С до объема 250 мл. Концентрат медленно добавляют к 2 л ацетона, охлажденного до +5 С, при энергичном перемешивании. Продукт светло- коричневой окраски в количестве 7,4 г промывают ацегоном и высушивают над пятиокисью фосфора. Полученный продукт характеризуется высокой активностью. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 П р и м е р 5. 2 л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, освобождают от твердых примесей центрифугированием и затем медленно выливают при перемешивании в 20 л ацетона, охлаждаемого льдом. Продукт отфильтровывают, промывают водой и высушивают над пятиокисью фосфора; вес продукта - 10 г. Продукт обладает полной активностью, присущей первоначальной жидкой среде.П р и м е р 6. Кусочки свежей телячьей шкуры погружают в 1 О/-ный раствор ферментного препарата (полученного, как описано в примере 5) в буферной среде Трис М/50 при рН 7. Выдерживают 18 час при температуре 37 С, после чего волосяной покров легко удаляют, осторожно соскребывая. Аналогичная обработка в буферной среде Трис без добавления приготовленного препарата оставляет волосяной покров таким же, каким он был до обработки.П р и м е р 7. Мицелий Трихофитон рубрум (один из грибков, вызывающих грибковое заболевание ног) приготовляют путем культивирования в сосуде, приспособленном для встряхивания в течение 24 час при температуре 26 С в среде, содержащей пептон и солодовый экстракт. Полученный мицелий отфильтровывают и суспендируют на уровне 0,2 /о в 0,2/,-ном растворе заранее приготовленного ферментного препарата (полученного, как указано в примере 5) в буферной среде Трис М/50 при значении рН 7. Мицелий полностью растворяется после трехчасовой выдержки при температуре 27 С.П р и м е р 8. Адсорбция ферментного препарата на каолине,К 600 ллл ферментациопной жидкой среды, полученной, как указано в примере 4, добавляют 1,65 г каолина, затем отдельными порциями вносят 180 г сульфата аммония при механическом перемешивании до полного растворения, Смесь каолина с протеином отделяют фильтрованием, промывают водой и затем высушивают при комнатной температуре в вакуум-сушильном шкафу. Продукт весом 11,7 г обладает полной активностью. присущей первоначальной жидкойл среде. Предмет изобретения Способ получения ферментных препаратов путем выращивания продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, необходимых для роста, например углеводов и минеральных солей, в аэробных условиях, с последующим выделением ферментных препаратов из полученной биомассы одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью получения препаратов с высокой активностью, содержащих протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина, а также лз201249 8пользуют бактерии рода Цитофага (Су 1 о 1 ара)Л (с Г 1 В 9497. Составитель М, АндрееваТехред Т. П. Курилко Редактор 3. Ыибаева,Заказ 3195/8 Тираж 535 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква. Центр, пр. Серова, д. 4 Типография, пр. Сапунова, 2 минариназу, хитиназу, эластазу и липазу, в качестве продуцируюших микроорганизмов исКорректоры: Л. В. Наделяееа и В. В. Крылова