Способ получения l-треонина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскизСоциааистичвскизРЕСИ фее(22) Заявлено 13.07,79 (21 2781356/28-13с присоединением заявки Мд И 11 М.КП. С 12 Р 13/08 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытийОпубликовано 110782, Бюллетень Мо 26 Дата опубликования описания 15.07.82(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ТРЕОНИ амяоспособ получе. культивирсвани микроорганизм сое 1 на пнтател ащей источник еобходимые ми ствии антибио елением целев я еральикаго уровень еводах, рая явем при, медкцин 0 ом Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения Ь-треонина,Треонин является незаменимой аминокислотой, которая ширско применяется как компонент различных питатель ных смесей медицинского назначения. Кроме того, Ь-треонин .может быть использован в качестве добавки в пищу человека и в корм животных, а так же как реактив для фармаиевтической и химической промышленности.В настоящее время Ь-треонин получают путем прямой Ферментации беэ предшествекников с использованием штаммов продуцентов таких видов как Вгеч 1 ЬассегЫт Наев, ЕесЬег 1- сЬ 1 а со 01, Сог 1 пеЬассег 1 цщ асесоас 1- ЙорЬИцщ, Ргосеце гедег 1 БеггаЫа щагсеесеце, АегоЬассег аегодепее, СогупеЬас 1 егШш дсцсалйсцв на питательных средах, содержащих в качестве источников углерода глюкозу, Фрук-тозу, ацетат, этанол или добавления витаминов и аминокислот или их содержащих субстратов, а также содержащих источники азота и необходимые минеральные соли.Известен способ получения Ь-трео- нина с использованием мутантных штаммов ЕесЬег 1 сЬ 1 а со 01 при глубин" ном культивировании на питательных средах, ссдержащих углеводы, источники азота, минеральные соли при добавлении в среду чистых аминокислот и витаминов или содержащих их гидролизатов белковой массы. При этом достигнут максимальный выход 10,4 г/л Ь-треонина в ферментационной среде за 96 ч ферментации 11,Однако применяемые мутантные шт мы ЕесЬег 1 сЬ 1 а сое 1 характеризуютс потребностью в изолейцине или в из лейцине и метионине. Известен такжеЬ-треонина путемпродуцирующих еговида ЕесЬег 1 сЬ 1 аной среде, содержлерода, азота и ные соли в присутпоследукжим выдродукта Г 2.Общим недостатком описаннспособов является невысокийнакопления Ь-треонина на углв частности на глюкозе, котоляется предпочтительным сырьпроизводстве Ь-треонина дляских целей, кроме того, слишбольшое время ферментаций (96-120 ч),на этом сырье.Цель изобретения - повышение выхода продукта и сокращение времениферментации.Поставленная цель достигается тем, 5что согласно способу в качествемикроорганизмов, .продуцирующих Ьтреонин, из вида ЕвсЬЕг 1 сп 1 а со 61используют штамм ЕвсЬег 1 сМа со 01ВНИИгенетика М, а в качестве ан Отибиотика - пенициллин.При этом пенициллин вносят в исходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л,Кроме того, культивирование ведут на питательной среде, содержащей питательную добавку в виде гидролиэата белковой массы, напримеркислотного гидролиэата, ферментолизата или автолизата дрожжей. 20Причем в процессе культивированияцелесообразно вводить сбалансированную подпитку, содержащую глюкозу и раствор аммиака.Штамм ВНИИгенетика Мотобран 25в рассеве штамма ЧЬ 334 р УВ 7. Отисхсдного штамма он отличается заметным мукоидным характером поверхности колоний, повышенной способностью к продукции треонина, более высокой стабильностью при росте на средах с питательными добавками, т,е, способностью пОпуляцииклеток сохранить основные свойства(продукция треонина и устойчивостьк пенициллину) после культивирования в этих условиях. Штамм девонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов при институтеВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМПМВ, 40Штамм ВНИИ-генетика Мсохраняет полезные генетические свойстваисходного штамма ВНИИгенетика7 Ь 334 р ХБ 7 (способность к сверхсинтезу треонина и устойчивость 45к пенициллину, что определяется содержанием в клетках амплифицированной гибридной плаэмиды рУХ 7), ноотличается от него рядом морфологических признаков, более высокой ста Обильностью сохранения своей популяции клеток в ходе ферментации насредах с питательными добавкамии способностью к более высокому уровню накопления Ь-треонина. 55 65 Введение в исходную питательную среду пенициллина 0,1-0,5 г/л позволяет использовать обогащенную питательными веществами среду беэ потери оснОвных свойств штамма и тем са .мым резко повысить скорость наращивания биомассы в начальной стадии ферментации, за которой следует .процесс интенсивного биосинтеза Ь-треонина. Предлагаемый способ предусматривает ведение процесса ферментации воптимальных условиях, за счет поддержания в ходе процесса оптимального соотношения углерода и азотаи постоянного уровня рН, что достигаетоя путем введения в ходе ферментации сбалансированной. подпитки,содержащей глюкозу и раствор .аммиайа.Предлагаемый способ позволяет получить в фермеитерах емкостью0,5 л до 30 г/л Ь-треонина эа 40 чферментации на питательной среде,содержащей глюкозу, минеральныесоли и питательные добавки в видегидролизата, ферментолиэата или автолиэата биомассы дрожжей при добавлении в исходную питательную средупенициллина 0,1-0,5 г/л.Характеристика штамма Езспег 1 сЬ 1 асоЕ 1 ВНИИгенетика М.Штамм ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 01 ВНИИгенетика М, продуцирующий Ь-треонин хранится в 1;ентралъном музее промышленныхмикроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номерВ.Морфологические признаки. Грамотрицательные слабо подвижные тонкие палочки с закругленными концами,размером 1,5-2 мм в длину.Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар, Через24 ч роста при 37 С образует круглые, беловатые, полупрозрачные насвет колонии, диаметром 2-3 мм, поверхность колонки, гладкая, краяровные или слегка волнистые, центрколоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная,легко эмульгируется,Агаризованная минимальная среда(Адамса) с глюкозой. Через 2-е сутроста при 37 вС образует колонии диаметром 1-1,5 мм, серовато-белые, круглые с ровными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная,поверхность блестящая, через 4-5 сутколонии приобретают слизистую (мукоидную)консистенцию.Рост в мясо-пептонном бульоне.После 24 ч роста при 37 ОС наблюдается сильное помутнение, небольшой оса"док, запах характерный.Рост в жидкой минимальной средеАдамса. Через двое сут роста при37 С с азрацией наблюдается сильноеоравномерное помутнение, запах отсутствует,Рост по уколу в мясо-пептонномагаре - хороший по всему уколу.Желатину - не разжижает.На.молоке.- хороший рост с коагуляцией молока.Индол - образует,Рост на различных углеводах. Хорошо растет на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе,глицероле и маннитоле с образованием кислоты и газа.Устойчивость к антибиотикам. Устойчив к пенициллину.Штамм не патогенен.Содержание плазмиды, В логарифмической стадии роста клетки содер.жат около 17 копий плаэмиды рУБ 7 (мол.вес 5,7 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и несущей гены треонинового оперона.Потребность в факторах роста. Растет на минимальной глюкоэо-солевой среде (время генерации 240 мин). Рост стимулируется изолейцином (время генераци 60 мин).Способ осуществляется следующим образом.Посевной материал культуры микроорганизма ЕэсЬег 1 сЬ 1 а со 01 ВНИИ- генетика Мвыращивают в течение 48 ч на агаризонанной минимальной среде, содержащей пенициллин (500 мкг/мл), и затем смывом физиологическим раствором клеток с поверхности косяка готовят клеточную суспензию, которую используют для засева ферментационной среды, Начальная концентрация клеток н рабочем ферментере может составлять около 2-5 10 кл/мл. Исходная питательная среда содержит глюкозу, минеральный азот., соли, .пенициллин и питательные добавки в виде гидролизатон белковой массы, например кислотных гидролизатов автолиэатон или ферментализатон дрожжей. Начальный рН среды устанавливают на уровне 7,0-7,2 и затем автоматически поддерживают в этих пределах в ходе ферментации с помощью датчика рН путем введения сбалансированной подпитки, содержащей аммиак (водный раствор) и глюкозу. В виду того, что снижение рН среды в ходе культивирования продуцента треонина обусловлено уменьшением концентрации аммония (азота) в среде вследствие. утилизации его продуцентом, а соотношение между скоростями утилизаци азота и глюкозы остается примерно постоянным, то соотношение между количеством данных компонентов в питательной смеси должно соответствовать соотношению между скоростями утилизации этих компонентов культуре продуцентом, что и достигается путем выделения н ходе ферментации вышеуказанной подпитки. Температуру поддерживают .на уровне 35-37 ОС. Через 40-43 ч ферментации образованный в питательной среде Ь-треонин выделяют следующим методом, Биомассу клеток продуцента отделяют либо сепарированием, либо фильтрованием после преднарительной обработки окисью кальция (известковым молоком) иортофосфорной кислотой. С учетомсодержания треонина и катионов в нативном растворе, а также пигментных5 соединений нативный раствор пропускают через ряд последовательно соединенных колонн с осветляющим сорбентом для поглощения окрашенныхсоединений и сульфокатионитом, на 10 пример, КУ-8, Диайон .8 КВ илидругим аналогичного типа в Н-форме,для сорбции катионов и треонина,Сорбированный треонин эллюируют сколонны с сульфокатионитом раствором аммиака. Фракции элюата, содержащие основное количество треонина, упаринают под вакуумом, охлаждают и кристаллизуют: треонин. Дляускорения кристаллизации может бытьиспользовано добавление спирта. Полученный трионин хроматографнческиоднороден и содержит 97-99 основного вещества. Для получения препаратов для медицинских целей достаточно пронести дополнительную перекристаллизацию. Такие препараты могутбыть использованы в средах длякультивирования клеток тканей. Выход по предлагаемому методу 80-95.При высокой концентрации треонина нкультуральной жидкости (вьют 18 г/л)относительно низком содержанйи примесЕй треонин может быть выделенбез использования стадии сорбции наионитах. Для этого оснетленный растЗЗ вор концентрируют уравниванием ввакууме при невысоких температурахи кристаллиэуют треонин прн пониженной температуре с добавкой илибеэ добавки этилового спирта, После 40 перекристаллиэации получают Ь-треонин с содержанием основного вещества 99.П р и м е р 1Посевной материал культуры продуцента Езспег 1 сп 1 а 4 со 61 ВНИИгенетика Мвыращивают втечение 48 ч на агаризованной минимальной глюкозосолевой среде, следующего состава, г/л: глюкоза 5;0;БН 4 СВ 1,0; КН 2 Р 04 1,5," Ба 1 НРО 4 3,5;50 Мд 804 7 Н 10 0,1; пенициллин 500 мкг/мл, и агар-агар 20,0; вода дистиллированная, рН 7,0-7, 2, Глюкоза и пинициллин стерилиэуются отдельно и добавляются в расплавленную среду передее охлаждением и посевом, Выросшуюкультуру смывают стерильной водопрой водной водой,; и полученную клеточ.ную суспензию используют для засеваферментерон.Ферментацию проводят на лаборатор ном ферментере емкостью 0,5 л.Состав исходной питательной среды, об.:Кислотный гидролизатБВК (в расчете на сухой вес) 0,3Пеногаситель 0,1Питательную среду стерилиэуют совмеотно с аппаратом, после чего вводят 5в среду стерильную глюкозу 2 и пенициллин 0,5 г/л. Ферментацию ведутпри температуре 35-37 ОС с.введениемсбалансированной иодпитки, содержащей аммиак в колкчестве 2,52,7 иглюкозу в концентрации 35. Подпитку вводят по сигналу датчика рН. Уровень рН устанавливают в пределах 7,0-7,2, сульфитное число фермента 3,5-4,0 г 01/л.ч. Через 40 ч 15 ферментации в культуральной жидкости накапливается Ь-треонин вколичестве 30 г/л, Затраты глюкозы на синтез треонина б г/г.Далее Ь-треонин выделяют из куль туральной жидкости. Для этого к300 мл культуральной жидкости с концентрацией треонина 30 г/л прибавляют при перемешивании 3 г окисикальция и затем добавляют ортофосфорную кислоту до достижения величины рН 5,6, раствор нагревают до бОеС выдерживают 10 мин и отделяют биомассу на Фильтре под вакуумом. Полученный нативный раствор (оптическая плотность 0,4 при 525 нм в 1 см кювете) пропускают через колонку с50 мл осветляющей смолы ИАр и осветленный раствор (оптическая плотность 0,08) пропускают через колонку со 150 мл сульфокатионита КУ-8в Н+ - Форме, колонку промывают300 мл водя. Сорбированный треонин элюируют раствором 3-ного аммиа-.ка, элюат упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ 25, добавляют этиловый спирт в соотношении 1;1 и оставляют кристаллизоваться в течение 10 ч при температуреОо +5 фС. Кристаллы Ь-треонина отфильтровывают, промывают и сушат, 45 Получают 8,1 г Ь-треонина (выход90). Анализ методом ТСХ (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислотП р и м е р 2, Посевной материал культуры продуцента ЕвсЬег 1 сМа соВ 1 ВНИИгенетика Мприготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут на ферментере емкостью 0,5 л. ,Состав исходной питательной среды 55 по примеру 1 за исключением того, что в качестве питательной добавки используют ферментолизат БВК в количестве О,бвместо кислотного гидролиэата БВК, Условия ферментации . 60 как в примере 1. Через 41 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается Ь-треонин в количестве 29 г/л. Далее Ь-треонин выделяют, из культуральной жидкости. для этого 65 300 мл нативного раствора треонина после отделения клеток продуцента центрифугированием культуральной жидкости (сухих веществ в нативном растворе 7,5 оптическая плотность О,б (525 мм) упаривают под вакуумом при 50 С до объема 50 мл, добавляют такой же объем этилового спирта и кристаллизуют треонин в течение 5 ч при ООС Полученные кристаллы отделяют Фильтрованием, промывают 15 мл этилового спирта и сушат. Получают 6,1 г Ь-треонина, не содержащего по анализу методом ТСХ (10 мкг) примесей других аминокислот.П р и м е р 3. Посевной материалкультуры продуцента ЕзсЬег 1 сМа со 01 ВНИИгенетика Мприготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут на ферментере емкостью 2 мЭ, Состав исходной питательной среды по гримеру 1, за исключением того, что в качестве питательной добавки в питательной среде испсльзуют автолнзат дрожжей в количестве 0,4, а содержание пенициллина 0,2 г/л.Через 43,ч ферментации в культураль. ной жидкости накапливается 18 г/лтреонина, Расход глюкозы " по примеру 1Таким образом, предлагаемый способ превосходит по эффективности все известные способы получения Ь-треонина на углеводной среде. За 40-43 ч Ферментации с использованием нового штамма ЕзсЬег 1 сЬ 1 а соИ ВНИИгенетика Мна обогащенной питательной среде с добавлением пенициллина в исходную питательную среду, способ позволяет получить в культуральной жидкости до 30 г/л Ь-треонина без примесей других аминокислот,Фсрмула изобретения1. Способ получения Ь-треонина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида ЕесЬег 1 сЬа со 81 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотика, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода Ь-треонина и сокращениявремени ферментации, в качестве микроорганизмов, продуцирующих Ь- трернин, из вида ЕзсЬег 1 сМа со 01 исполвзуют штамм, Езспег 1 сМа соИ ВНИИгенетика И, а в качестве антибиотика - пенициллин.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что пенициллин вноЗаказ 5037/34 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий 113035, Москва, З, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная,.4 сят в исходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л.3. Способ по п.1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержа щей питательную добавку в виде гид 5 ролизата белковой массы, например кислотного гидролизата, Фермеитолизата или ввтолизата дрожжей.4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в процессе уль тивирования вводят сбалансированнуюподпитку, содержащую глюкозу и раствор аввкиака Источники информации принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Англии В 1223470,кл. С 2 С опублик 1971.