Способ получения пуллулана

Союз СоветсюаСоцио алмстмцесюаРеспублик и,735177 й) Дополнительный к пате22) Заявлено 9.10,72 (21) ту(51) М 34802 28-13 3) Приоритет 11,10.73 (32) 7941 1201 Гаеударотеениый комет СССР оо делам изооретеиий и открытий(72) Авторы изобретени Иностранцыо Като и Макото Сиесака (Япония) Иностранная фирмаБиокемикал Лабораториэ инкорпорейтед" (Япония) Хаясиб 1) Заявите СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУЛЛУЛ Изобретение относится к микробиологической промьппленности, а имегйо к получениюполисахарида пуллулана путем аэробной микробной ферментации.Известен способ получения пуллулана путем бвырашнвания пуллулан-синтезирующих микроор.ганиэмов в аэробныхусловиях в питательнойсреде, содержащей источники углерода и азота,небольйие количества необходимых для ростапитательных веществ, с последующим иэвлече. 1 Онием пуллулана иэ культуральной жидкости.Однако выход продукта в известном способедовольно низкий,.С целью повьппения выхода продукта предложено в качестве источника углерода применять крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент (ДЭ) 20-70, преимущественно35-60.В этом случае крахмальный гидролизат состоит в основном из олигосахаридов, Целесооб- Яразно контентрацию поддерживать гидролизатав питательной среде 5 и 15 вес.%.Рекомендовано применять следующие микроорганизмы: Рц 11 ц 1 ага 1 егвептапв чат.Ееггпеп -тапа ЕО 6401, Рц 1 ц 1 аг 1 а 1 еггпептапа чаг. 6 вса .ЕО 6402, Рц 1 ц 1 ага рц 11 цапа АВО 9553, Рц 1 ц -аг 1 а РО 11 цапа 1 РО 6353 или Оееат 1 цй рц 11 ц -апа 1 ЕО 4464. Для ферментации пуллулана можно исполь. зовать крахмал, полученный из различных ис. точников: кукурузы, пшеницы, картофеля и цр.Если используемое сырье только частично состоит из крахмала, например рисовая мука, рисовые, отруби, овсяная крупа, его обраба.тывают й. амилазой при 50-70 С и отфильтровывают полученный водный раствор для удаления нерастворимого материала.Сироп гидролизованного крахмала, необхо. димый для ферментации, можно получить с помошью кислотного или ферментативного гидро- лиза. 1 идролнз необходимо проводить таким образом, чтобы избежать образование продукта, имеющего ДЭ ниже "О, который может содер. жать непрореагировавший декстрнн.Дгя проведения кислотного гидролиза к взвеси крахмала в впде цобавлянтг цавелевую или соляную кислоту до рН 2 или ниже, смесь77 4вать содержащийся в ней фермент. Микробныеклетки удаляют центрифугирова кием,К жидкости, освобожденной от клеток, добавляют метанол или другой органический раст.воритель, хорошо растворимый в воде и неРастворяющий пуллулан, в количестве, доста"точном для осаждения пуллулана.Осажденный пуллулан извлекают иэ жидкости и очищают повторным растворением в водеи осаждением органическим растворителем,Очищенный пуллулан представляет собойбеловатый порошок, который очень легко растворяется в воде с образованием вязкого раствора,Средняя степень полимеризации пуллулона,полученного данным способом, приблизительно.1000-3000,П р и м е р 1. Оетатаа РцПоапв Р 04464выращивают в среде, содержащей 10% источникауглерода, 0,2% пепгона, по 0,2% КэНРО 4 и йаС 3,0,04% М 980 д 7 Нэ 0 и 0,001% Ее 3047 Нэ О.В качестве источника углерода добавляют глюкозу, сахарозу, мапьтозу (ДЗ 60,5), кислотныйгидролизат крахмала (ДЭ 45) и ферментативныйгидролизат крахмала с ДЭ 40, Начальный РН сре.;цы 7,5,Кислотный гндролиз и комбинация кислот.ного и ферментативного гидролиэа обеспечива.ет получение крахмального сиропа, имеющегоДТЭ 50 или выше, ДЭ гидролиза, полученноготолько обработкой й-амилазы, не бьвает выше35.Питательная среда должна содержать другиевещества, необходимые для роста микроорганизмов, такие как органические или неорганические источники азота, неорганическиесоли,например фосфат калия, натрий хлористый, магний сернокислый, железо сернокислое "и тд.Начальный рН культуральной среды долженбыть 5-7,5, температура ферментации 27-30 С.Самая высокая концентрация пуллуланаобычно достигается через 3-8 сут, когда в сре.де не остается, остаточйого сахара,Степень полимеризации пуллулана имеет тенденцию к уменьшению с увеличениемвремениферментации, поэтому если требуется продуктс высоким молекулярным весом, ферментацию36прерьвают до достижения более высокого выхода продукта.Аэрирование культуры осуществляют обычным способом, Условия аэрации не оказьваютосущественного влиянияна выход продуктаПосле окончания ферментации культУРальную жидкость прогревают, чтобы инактивироТаблица 1 Пока зател Источникуглеродав среде Выход продукт сахар в среде,г 100 мл среды/ 37351выдерживают прн 120 С до тех пор, пока неполучится требуемый ДЭ,Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют карбонатомкальция и/или натрия, обесцвечивают актнвированным углем и очищают от посторонних ионов.с помощью ионообменной смолы.Обесцвеченную жидкость можно использовать для приготовления питательной среды,Крахмальный гидролизат можно также получить обработкой только й -амилазой или комби.нациой кислотного и ферментативного гидролиза,Выращивание осуществляют в колбах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на круговой качалке при 27 С в течение 7 сут, Пробыотбирают через 3,5 и 7 сут и центрифугируют,К освобожденной от клеток культуральнойжидкости добавляют 3 объема метанола дляосаждения полисахарида, который очищаютдважды растворением в небольшом количествеводы и переосаждением метанолом.Собранные осадки промывают метанолом, высушивают и взвешивают,Осадки идентифицированы как пуллуланпщролизом их пуллуланазой и бумажной хроматографией гидролизатов,Результаты пРедставлены в табл. 1.(ДЭ 45) 5,5 7 Ферме нтативгидролизатмала (ДЭ ыи ах 5 65 1,8 51 2,0 0 0 м е р 2, Ро 11 о 1 ага рц ают в условиях, описанны , содержащих глюкозу, са гидролиэованный в два э 1 апв АНО 9593в примере 1,арозу, маяьтозу 5апа: кислотой ахмал, гидролиэо.табл. 2 приведен выходы пуллу. и ферментативно до ДЭ 46 и кванный кислотой до ДЭ 43.ны значения остаточнбго сахалана на разных средах. выра на ср аблиц т Остаточныи сахар,г/100 мл ерод сточни ыход пулдсред люкоза ахароз альтоз рахмал, гидролизованный в два этапа (ДЭ 46рахмал, гидролизован. тй кислотой до ДЭ 43 5 О,Полученный пуллулан слегка окрашен.11 р и м е р 3, РоИцага ро 11 оапа Ф 08353 в примере 1,выращивают в условиях и на средах, описанных лизата крахм50в примере 1, но длительность ферментации ного исто5 сут. Выходы пуллулана ниже, чем в примере 1, После феротак как продолжительность ферментации меньше, . ке при 27 С,но на среде с гидролизатом крахмала пуллулана точных сахарсинтезировано на 25-30% больше, чем на среде ванием,55с сахарозой или глюкозой, Клетки удаляП р и м е р 4, Рц 11 ц 1 ага роИц 1 апа маг. клеточной жидк1 цвса 1 РО 6402 вырацивают в среде, описанной метанола. Осад содержащей 15 аласДЭ 35,в чника углерода.ментации в теч когда в среде ов, фермент ина гидро.ствен.% кислотн качестве е ние 8 сут на;начале содержалось оста. тивируют прогре. пуллулан осаждают иэ добавлением трех объе еляют и очищают повт ют ок7 73517растворением в воде и переосахсдением метано;лом.10%-ный водный раствор очищенного пуллу.лана обрабатывают пуллуланазой, выделеннойвз культуральной жидкости АегоЬастег, затемобесцвечивают активированным углем, очищаютот ионов ионообменной смолой и частично упариваю до получения бесцветного сиропа,По результатам хроматографичсского анализа и определения восстановительной способности 10продукт содержит чистую мальтотриозу.Выход мальтотриозы 95%,30%-ный водный раствор мальтотриоэы помещают в автоклав с 0,30% карбоната кальция и10% никеля Ренея, осажденного на твердых15частицах, присутствующих в растворе.Мальтотриозу подвергают гидрированию при100 С и давлении водорода 100 кг/см . Прогидрированную смесь профильтровывают дляудаления катализатора, фильтрат обесцвечивают20и очищают от примесных ионов, как описановьппе.Бесщетщя жидкость не обладает восстанови.тельной способностью и при гидролизе дает25глюкозу и сорбит в молярном сротношении2:1.Таким образсм, продукт гидрирования -мальтотритол, Получен из мальтотриозы с выходом 96%.Ниже приведена характеристика штаммов,30Рц 1 ц 1 ага Хеггпептапв чагЛегтептапв 1 ЕО6401,Бластоспоры 3-4 на 7-10 мкм, хламидоспорьг13-15 мкм,артроспоры 5.7 на 10-15 мкм,кладоспорные образования 9-17 мкм,Черные колонии с белым поверхностным мице.лием на кукурузном агаре и агаре Сабурода.Пигмент образует только в аэробных условияхпериодически на среде Литтмана и не образует на .40питательном агаре,Воздушный мицелий образует периодически.При 37 С не растет.Сбраживает глюкозу, манноэу, фруктозу, маль.тозу, сахарозу и рафинозу.РцПц 1 ага гтептапв чаг. Хцвса 1 ЕО 6402,45Бластоспоры 3-4 на 1113 .мкм, хламидоспоры 13-16 мкм, артроспоры 3 б на 8-12 мкм,кладоспорные образования 4-6 на 14 мкм.Черные мукоидные колонии с черным по.50верхностным мицелием на кукурузном агаре, ага.ре Сабурода и Литтмана,Пигмент периодический в анаэробных условиях, иа питательном агарс отсутствует.Воздушный мицелий не образует. При 37 Ърастет. Сбраживает гликоэу, манноэу, фруктозу,55мальтозу, сахарозу, рафинозу и ксилозу. Кольцапелликлов были найдены в растворе.Рц 11 цага рц 11 цапв АНИ 9593. 7 8Бластоспоры 3.4 на 7-11 мкм, хламидоспо-ры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7.10 мкм,кладоспорные образования 3.5 на 12.14 мкм.Маленькие черные колонии с эеленоваточерной поверхностью и воздушный мнцелийна кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана.Пигмент образует только в анаэробныхусловиях. Растет при.37 С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком.Углеводы не сбраживает.Рц 11 ц 1 ага рц 1 цапв 1 ЕО 6353,Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм.Маленькие черные колонии с зеленовато.черной поверхностью и воздушный мицелий накукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана,Пигмент образует только в анаэробных условиях,Растет при 37 С. Пелликлы в растворе былинайдены со слабым осадком,Углеводы не сбраживает.Оеп 1 ат 1 цт рц 1 ц 1 апвЕО 04464,Бластоспоры 3-4 на 8-12 мкм, хламидоспоры8-10 на 14-18 мкм, артроспоры 2-3 на 3-5 мкм.Маленькие черные колонии с зеленовато.черной поверхностью и воздушный мицелий на ку.курузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана.Пигмент образует только в анаэробных условиях.Растет при 37 С.Углеводы не сбраживает,Формула изобретения 1. Способ получения пуллулана путем выращивания пуллулан-синтезирующих микроорганизмов в аэробных условиях в питательнойсреде, содержащей источники углерода, азота иминеральные соли с последующим извлечениемпуллулана иэ культуральной жидкости, о т л ич а ю щ и й с я тем; что, с целью повышениявыхода продукта, в качестве источника углеродаприменяют крахмальный гидролизат, имеющийдекстрозный эквивалент 20-70, преимущественно35 60,2. Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что применяют крахмальный гидролизат,в основном состоящий из олигосахаридов.3, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятемчто концентрацию крахмального гидролиэата в питательной среде поддерживают в диапазоне 5 15 вес.%.4. Способ по пп.1.3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штаммРцИц 1 ага 1 егтептапв чаг, 1 егвептапв 1 ЕО 6401.Составитель Л, МинееваТехред Л.Теслюк Корректор Н,Степ Редактор Н, Потапова Заказ 2120/58 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 9 735177 105. Способ по пп, 1-3, о т л и ч а ю щ и й. 7, Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующе- с я тем, что в качестве пуллулан.синтезируюго микроорганизма применяют штамм Рц 11 ц 1 а - щего микооорганизма применяют штамм Рц 11 ц - г 1 а 1 егвептапа чаг, 1 цвса 1 РО 6402. 1 ага рц 11 ц 1 апа .1 ГО 63536, Способ по пп,3.3, о т л и ч а ю щ и й8, Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулансинтезирую. с я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм РцПц - щего микроорганизма применяют штамм Оепза 1 аг 1 а рц 11 ц 1 апа АНИ 9593. т 1 вп рц 11 ц 1 ам 1 РО 4464.