Способ получения антибиотика

(11) 561520 ИЗОБРЕТЕН Ия лнительный к тенту 22) Заявлено 08.10.64 45 13 1) М, Кл,С 12 23) Приори осударстеенныи комет Совета Министроа ССС оо делам иаооретений и открытий(45) Дата опубликования описан 9.12,7(2) Авторы иэобретени Иностранцыеон Нине и Жа(Франция) Дениз Мо ед Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА гмент ствуют.Глюкозо-аснара Субстратцый мкоричнево- желтого.25 вается через две не.иновый аг щелий от Воздушц дели, развиелтая, окрашивается в местах, где образуется и мицелии развитие умерегцюе, цвет ко Изобретение касается медицины, в частности производства антибиотиков,Предлагается способ получения нового антибиотика 11.837.ЯВ где в качестве гриба- продуцецта используют штамм Зтгертотусеа ч 1 паапа МВВ 3687. Штамм представлен лабораторией ИВЯ в Преории (США) под ссылкой "1 чВЯ 13687".Этот организм выделен из образца почвы, взятой в окрестностях Мадраса в Индии. Видовые признаки штамма соответствуют признакам описанным для Бтгертопусез Ч 1 пдапа.Основные характерные признаки штамма Ятгертоеусеа ч 1 гдаЙа 1 чВВ 1. 3087. Вегетативный мицелий от желто. сероватого до светло-желтого цвета или коричнево-желтый.Воздушный мицелий от светло-серого до тем. но.серого цвета, порошкообразньд, хорошо развивающийся. Длинные спорофоры, одноногие, заканчиваюшиеся цепями спор, включенных в концевые пучки, способные иметь ответвления вдоль своего основного стебля. Споры цилиндрические размером Са,7-0,9) х (1,3- 1,5)Агар. агар Беннетта. Развивается хорошо. Обратная сторона серовато-жричнево-зеленый цвет в растворимый пигмент, Воздушный мицелии от свет.ло-сероватого цвета до темно-серого. Пирастворимый, зеленого цвета.Мальтозо-трнптоновый агар-агар.Степень развития хорошая. Обратная сторонаколоний серовато-желто. коричневая. Воздушныймицслий от беловатого до серого цвета. Растворимьп пигмент коричнево. серый, неяркий.Агар- агар Э ме рс она Ю 23) .Субстратный мицелий светло.коричнево-желтый, развит хорошо. Воздушный мицелий беловатый. Растворимый пигмент отсутствуст.Глюкозо-пептоновый агар агар (В 7).Субстратцый мицелий светло-желтый, развитхорошо. Воздушный мицелий беловатый, очекумеренный. Растворимый пигмент желтоватый,Питательный агар-агар (Я/-5) .Степень развития слабая. Субстратный мицелийсветло-серовато.желтый, Развитие умеренное. ВозО душный мицелий и растворимъ 1 й пигмент отсут 561520от беловатого до сероватого. Растворимый пигмент отсутствует в течение двух недель. Через месяц цвет зевдато - серый, количество незна пггепьноеГл.щерино.аспарапиовыя агар-агар В.З), Суб:гратный ьпгцелщ коричневато-эхелтьй с иерелдиргымк спегьщ зелечоватого цвета. РоздупньБл мацелзя бело сероватьй, светло" серо ватьй, Разков умеренное. Растворимьй пигмент коричнево-серый с небопыпим кожкеством зелено. ватого и серо-зеленого.Агар агар с малатом кальция Ыраинского.Обоатная сторона колоний светло-желто-серо. ватая, Воздушный мицелий беловатый, светло-серый. Растворимый пигмент сероватьй или отсутствует,Агар-агар с тирозином.Обратная сторона колоний желто.коричневая, Воздушньй ьщцелий желтоватый, умеренно раэвитьщ, Растворпмьй пигмент желто.кори иевый,Агар-агар с крахмалом % - 11),Обратная сторона колоний от зеленовато-серой до темно-зелено-коричневого наета, Воздушный мицелий беловатый и серый, умеренно развитый. Растворимый пигмент беловато-зеленьй, зелено. вато. серый.Агар-агар с крахмалом Придам.Обратная сторона колоний серовато-желтая, Воздушный мицелий светло-серый, достаточно хорошо развитый. Растворимый пигмент отсутствует, Гидролиз крахмала средний.Синтетический агар;агар Чапека с глицерином.Обратная сторона колоний светлосерая и желтокоричневая, Окрашивается в зеленовато-коричневыйцвет в процессе образования растворимого пигментазеленого цвета. Воздупный мщелй беловатый нсерый. Растворимый щ;мент светло-желтый, коричневый, При добавлении к среде земли пигментпо мере старения становится серовато-коричневыми темно-зелено-коричневым, почти черным,Среда на картофеле (В).Субстратный мицелий зеленовато-коричнево-желтого и темно зеленого цвета, по мере старения культуры - черно-коричневого цвета. Воздуш.ный мицелий от беловатого до светло. серого, раз.витие умеренное. Образование растворимого пиг.мента запоздалое, обильное, черно.зеленого цвета спереходом в зеленоватый, распространяется по всейповерхности картофеля.12 о ный чистый желатин,Воздушный мицелий от беловатого до сероватогоцвета, развитие умеренное, Растворимый шпмент образуется через две недели, Через месяц .желтовато. серого цвета,Питательная среда с нитратом.Беловатое кольцо на поверхности. среды, Воздушнъй мицелий беловатый, развитие очень мед. ленное, Раствориьп ж пигмент отсутствует.Глюкоза.нитратиая среда. На поверхности среды легкое кольцо и пленкаот серовато белого до светло желтого цвета, развитие умеренное. Воздушный мицелий отсутствуетили беловатого цвета (следы), Раствориыай пиг.мент бледа.желтый,Синтетическая среда Чапека с целлюлозой.Воздушный мицелий серый, хорошо развитыйпо всей поверхности бумаги, погруженной в средуСнятое молоко.10 а) при температуре 26 С . хорошо развитоекольцо бледно-желтоватого цвета. Воздушныймицелий отсутствует либо наблюдаются следы бело.ватого цвета;б) при теьшературе 37 С. среднеразвитое коль.15 цо от светло-желтого до светло. желто-коричневогсцвета, Воздушный мицелий отсутствует, либо следыбеловатого цзетв.Желатин умеренно превращает в жидкое состоя.ние2 О Молоко медленно пептонизируется с небольшойкоагуляцией при 37 С,Крахмал быстро гидролизуется,Реакция нитратов положительная,Сероводород не образует,Тирозин и малат кальция растворяет хорошо,Оптимальная температура роста штам 25 28 оСпособ получения антибиотика осуществляютследующим образом,ЭО Культуру Зтгертовусеэ аддам МЯЯ 3687выращивают и глубинных условиях в, ферментационном аэробном процессе на питательной среде,содержащей источики углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста.В качестве источника углерода можно использовать глюкозу, сахароэу, лактозу, декстрины,крахмал, сахарную патоку или органические кислоты: молочную, лимонную, винную.В качестве истощщка азота могут быть лри.4 О менены нитраты, минеральные и органические .;олиаммония, мочевины, аминокислот, а также казеин,молочный альбумин, соевая мука, мясной экстракт,дрожжи, растворимые дистилляты и другие.Иэ неорганических солей питательная среда45 может содержать щелочные или щелочноэемельныефосфаты, карбонаты кальция или магния, а такжеактиваторы роста - соли цинка, кобальта, железа,меди, марганца.Ферментацию проводят при те мне рату.ре 25-28 С, рН среды 6,5-7,5 и скорость аэра.щв 0,3-2 л/л мин. Максимальный выход продуктачерез 4-7 дней культивирования.Антибиотик иэ культуральной жидкости вьщеляют известными способами с учетом его химических, физических и биологических свойств.Активность антибиотика определяют методомдиффузии, используя ВасИЬз в качестве тест орга.Антибиотик 11.837, В. В. является сильной кислотойнейтральный эквивалент которой 600 (рКа:4,1).. АморфнМй белый порошок разлагается при температуре 160 С, Инфракрасный спектр антибиотика в бромистом калии представлен на черте. же, на котором на оси абсцисс (нижняя шкала) ншесена с одной стороны длина волн, выраженная в мвсронах, я с другой стороны (верхняя шкала) . асло волн в сантиметраха на оси ординат . передача в процентах,Б акте риостатическую активность антибиоти. ка 11.8.37.П.В. определяют методом разжижения.Результаты различных определений представлены в таблице, где минимальные бактериостатические концентрации выражены в микрограммал субстанции на 1 см испытуемой среды. Антибиотик обладает большой продолжительность- действия и слабой токсичностью.П р и м е р 1. Ферментер емкостью 170 л разгружают средой следующего состава (в кг):Замочснное зерно 4,8 Водная глюкоза 2,4 Хлористый натрий 0,6 Сульфат магния 0,12 Вода, л до 100После установления рН среды 7,15 575 см концентрированного натрия (д - 1,33) добавляют 0,6 кг карбоната кальция.Питательную среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем среды составляет 120 л, а рН 7,15, Среду засевают 200 мл культуры 81 гер 1 ощусез агЫапз ИВВ 3687 и инкубиру 1 от при температуре 26 С в течение 28 ч при непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом.Фср мента био осуществляют в ферментере объемом 350 л на ферментационной среде следующего состава (в кг):Соевая мука 8,0 Растворимые дистилляты 1,0 Крахмал 3,0 Карбонат кальция 2,0 Хлорисгый натрий 2,0 Хлористый водный кобальт (6 НО) 4,0 Соевое масло, л 3,0 Вода, л 180 рН среды 7,05. Среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мин, После охлаждения объем среды 200 л, рН 7,15.Ферментационную среду засевают 20 л, подго товленного описанным выше образом инокулята. Юерментацию ведут при температуре 26-27 С в течение 138 ч при перемешивании и аэрации стерильным воздухом, рН среды 7,9, объем ферментациоююй массы 180 л.Концентрация антибиотика в ферментационной массе 4515 лсмз. П р и м е р 2. Ферментацию осуществляют вфермеитере емкостью 350 л на ферментационной среде следующего состава:Налюченное зерно, кг 6 5 Крахмал, кг 2Соевое масло, л 3 Хлорнстый водный кобальт (6 Н 0), г 4 Вода, л 175рН среды устанавливают 5,9 380 см кон.10 центрированного натрия (4-1,33) и добавляют 1 кгкарбоната кальция. Среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мин, После охлаждения к среде добавляют стерильные 0,4 кг суль.фата аммоитя и 5 л воды. рН среды 6,8, объем15 200 л.Далее среду засевают 20 л инокулята, подготопленного, как описано в примере 1.Ферменташпо осуществляют при температу.ре 26-27 С в течение 144 ч при перемешиванни и 2 О азращи стерильным воздухом, рН ферментацион.ной массы 8,4, концентоация антибиотика 3 сд ( 3П р и м е р 3. В 200 л ферментационной среды срН 8,4, имеющей титр 2855 л/см устанавливают 25 рН 3 Яй раствором соляной кислоты в резервуаре,снабжещюм неремешивающим устройством, Затем добавляют 12 кг вспомогательного средства фильтрации, Смесь фильтруют через фильтр-пресс, а остаток фильтрации промывают 60 л водопровод- чО ной воды. Фнльтрат и промывную воду выбрасывают как отходы. Остаток фильтрации взбалтывают в 150 л смеси бутанола и метанола (2:1); рН смеси доводят до 6 10 н, растворол натрия, Перемешивание ведут в течение 30 лан, затем сл 1 есь фильтру ют через фильтр. пресс. Фильтрат собирают, а оста.ток прол 1 ываот 30 л смеси бутанола и метанола.185 л промывочной воды и фильрата имееттитр 2075 л/см . Спиртовьп 1 фнлырат концентрируют под давлением 20 мм рт.ст при температу ре 35 С до объема 2 л.Выпавший в осадок антибиотик отделяютфильтрованием, промывают ацетоном и высуши.вают в сушильном шкафу под вакуумом (5 мм рт,ст.) .45 Получают 254 г зелено. серого вещества, имеющего титр 1025 л/мг. П р и м е р 4. 375 л ферментационной массы срН 79 пропускают через сито для удаления круп.50ных частиц, рН доводят до 7,5 н, раствором солянойкислоты при пере мешивании. Затем добавляют 22,5 л смолы ПОМЕХ 1 х 2 в хлористом цикле, перемешивают 2 ч, после чего смесь пропускают через 55вибросито. Смола задерживается на сите, а среду выбрасывают. Затем смолу загружают в колонну и последовательно промывают 50 л 5 Я.-ного водного раствора хлористого натрия и 10 л воды. Промытую смолу обезвоживают, пропуская 20 л метанола. Адсорбированное вещество извлекают раствором метанола с 20% воды и 2,8% хлористого аммония.561520 8воды, затем 2,5 л смеси метанол-вод (80:20 пообъему),Антибиотик элюируют 10 л смеси метанол-вода,содержащей 7,5 г/л хлористого калия, Элюат концентрируют до 400 см под давлением 20 мм рт,ст,при температуре ниже 40 С. Концентрат диализируют против дистиллированной воды в течение 24 чпосредством целлюлозной пленки для удаленияминеральных солей и органических примесей,1 О 650 см диализированного раствора концентрируют под.давлением 20 мм рт. ст. до объема 125 смАнтибиотик осаждают путем дбпзвления Ю, объемов смеси эфир-ацетон-изопропанол (10: 10:10). После фильтрации, промывки в ацетоне ио15 высушивания в течение ночи при температуре 35 Спод давлением 2 мм рт.ст. получают 8,25 г светло-серого порошка с титром 24-600 и/мг. Вид бактерий Ятар 1 ту 1 ососсцз ацгецв, зоцсбе 209 Р-АТСС 6538 Р 0,15------ зоисйе 133 (1 пст 1 тцт Разтецг) 0,15воцс 1 те Яп 1 т 150 Яагс 1 па 1.итеа - АТСС 9341 50 0,6- " - " - " - руоцепез Ьевоут 1 сцз (воцспе Р 1 д 7,1 пзттцт Равтецг)7Элюаты концентрируют под давлением 20 мм рт,ст, до объема 3 л, Концентрированный раствор с титром 92.950 и/см и удельпммвесом 1,057 диализнруют в течение 48 ч против дистиллированной воды при помощи пленки типа целлофан. Объем раствора 4,7 л, удельный вес 1,025. Раствор концентрируют поддавлением.з мм рт. ст, до 1 300 см, затем лиофилизируют. Получают 48 г неочищенного вещества с титром 6530 л/мг. П р и м е р 5. 250 г неочищенного антибиотика, полученного по примеру 3, растворяют в 4 л воды при рН 8, Водный раствор фильтруют, пропускают через колонну, содержащую 2,7 л нонообменной смолы до Э ЕХ 1 х 2 в хлористом цикле; обрабо. таннло воду удаляют. Смолу промывают 2,.5 л Зтгертососсцз йзса 1 в - АТСС 9790- " - " - " - аг 1 дапз - (1 пзт 1 тцт Равтецг) Вас 1 11 цв вцЬт 111 в - АТСС 6633 сегецз / - АТСС 6630 МусоЬастег 1 цпт врес 1 ев - АТСС 607 Евс 1 тег 1 сЫа соб - АТСС 9637 Минимальные бактериостатические концентрации, мг/смз561520 10 Продолжение таблицы 165 60 Рвецдопюпав аегицеова (зоцсЬе Вавз - 1 застит Равтеиг 1 Вгисейа Ьгопсйвербса СИ - 387 - ВеИсоае Ьзттцт)- аЬогтцв Ьочв В 9 РавтецгеНа пзцтосЫа (А 125, 1 пвбтцт Равтеиг) 1,5 ТгеропЬпе де Ве 1 тег 20 Формула изобретенияСпособ получения антибиотика, о тл и ч а ющ и й с я тем, что культуру Ятгертовусев чгЫапв ыВВ 1 3687 выращивают в аэробных условиях нз Уд 77 Ю Составитель Г. Смирноваехред В, Куприянов Корректор А Власенкод р Л, Ушакова Заказ 1694/161ЦНИИПИ одписное, г, Уагород, ул. Проектная, 4 4 ИР УО Ргогецв чцяагв - А 244К 3 еЬв еИа рпецаовае - АТСС 10,031. Государственно по делам из 13035, Москва,питательной среде, содержащей источники углерода,азота, минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.известными приемами,комитета Совета Микистроретенмй и открытий