Штамм гриба aureobasidium pullulans 23 продуцент полисахарида аубазидана

ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM PULLULANS 23 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИСАХАРИДА АУБАЗИДАНА.
Штамм гриба Aureobasidium pullulans (Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ F-292) - продуцент полисахарида аубазидана.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба, продуцирующего внеклеточный полисахарид аубазидан, предназначенный к применению в качестве вспомогательного средства при приготовлении, например, основы мазей, стабилизатора суспензий и эмульсий в фармации.
Целью изобретения является получение нового штамма гриба, обладающего повышенной способностью к биосинтезу аубазидана.
Штамм гриба Aureobasidium pullulans 23 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ F-292 и имеет следующие морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки.
Морфолого-культуральные признаки. При росте в жидких средах (сусло, глюкозопептонная и морфологическая) без встряхивания через 3 сут при 20^оС клетки округлые с перегородками размером 11,37-13,02 мкм, соединенные в цепочки и конгломераты разной величины; одиночных бластоспор мало. Развитие культуры сопровождается быстрым помутнением среды, образованием осадка и формированием на поверхности среды кольца, которое через 5-7 дней перерастает в плотную слизистую пленку бледно-бурого цвета шириной 5-10 мм. При росте на морфологическом агаре штрих культуры светло-бежевый, блестящий, пастообразный с неровным краем. На сусле-агаре штрих культуры светло-серый, опущенный, покрытый воздушным мицелием белого цвета, складчатый с неровным краем. Через 30 дней меланиноподобный пигмент не образуется. На морфологическом агаре формирует гигантские колонии диаметром 40-50 мм, светло-бежевые, ровные с бугорком в центре, блестящие, пастообразные, край неровный. При развитии на сусло-агаре образует гигантские колонии диаметром 48-50 мм, светло-серые, опущенные, поверхность неровная складчато-секторная диаметром 10 мм, край изрезанный.
Физиолого-биохимические признаки, Аэроб. Оптимальная температура 24-25^оС, при температуре 30^оС рост слабый, при 33^оС не растет. Интенсивно ассимилирует D-глюкозу, D-галактозу, L-сорбозу, DL-фруктозу, L-арабинозу, сахарозу, мелибиозу, целлобиозу, мальтозу, раффинозу, D-маннит, D-сорбит, L-рамнозу, D-ксилозу, инулин, глицерин, i-инозит, этанол. Удовлетворительно растет при использовании трегалозы, салицина. Культура плохо ассимилирует растворимый крахмал, лимонную, молочную, яблочную и янтарную кислоты и совсем не ассимилирует лактозу, -метил-D-глюкозид и дульцит. Уксусная и муравьиная кислоты ингибируют развитие данного гриба. Не сбраживает D-глюкозу, D-галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мелибиозу, лактозу, целлобиозу, -метил-D-глюкозид, раффинозу, инулин, растворимый крахмал; использует нитраты, нитриты и аммонийные соли в качестве единственного источника азота в среде. Хорошо растет в безвитаминной среде, крахмалоподобных соединений не образует. Культура осмотолерантна: растет на среде с 50% глюкозы. Хорошо развивается на среде, содержащей NaCl в концентрации до 8%. Обладает высокой уреазной активностью, разжижает желатин, гидролизует жир, кислотообразование умеренное.
Для получение нового штамма была изучена индуцированная изменчивость А. pullulans штамма 8 под воздействием 0,05%-ного водного раствора N-нитрозо-N-метилбиурета по морфолого-культуральным признакам и образованию полисахарида. Из рассева штамма 8 после обработки N-нитрозометилбиуретом на полной среде выделен штамм 23.
П р и м е р 1. Лабораторную проверку штамма 23 на полисахаридообразование в сравнении с исходным штаммом 8 проводят на среде Чапека-Докса с 5% сахара. Штамм А.pullulans 23 выращивают на сусле-агаре в течение 7 сут при 25^оС. Выросшую культуру используют для засева посевных колб вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды Чапека-Докса с 3% сахара. Для засева посевной колбы берут 1 см² мицелия гриба с косого агара. Выращивание посевного материала производят на качалке (220 об/мин) при 25^оС в течение 48 ч. Выросшим посевным материалом в количестве 5 об.% засевают ферментационные колбы вместимостью 750 мл, содержащие 100 мл среды Чапека-Докса состава, г/л: NaNО₃ 3 К₂НРО₄ 1 MgSO₄ 7H₂O 0,5 HCl 0,5 FeSO₄ 0,01 Сахар 50,0 рН среды до стерилизации 6,2-6,4. Среду готовят на дистиллированной воде и стерилизуют при 0,202 МПа (1 ати) 40 мин. Продолжительность ферментации 96 ч при 25^оС. По окончании ферментации в культуральной жидкости определяют содержание нативного аубазидана (сухую массу внеклеточного полисахарида совместно с клетками). Для этого в пробе культуральной жидкости, равной 10 мл, осаждают полисахарид вместе с клетками двумя объемами 96^о-ного этилового спирта и осадок высушивают при 105^оС до постоянной массы.
Средняя продуктивность штамма А. pullulans 23 по образованию нативного аубазидана при ферментации на минеральной среде Чапека-Докса составляет 1358 мг%, что на 82% превышает продуктивность исходной культуры 8. Результаты сравнительного изучения штаммов 8 и 23 приведены в таблице.
П р и м е р 2. В среду Чапека-Докса вводят дрожжевой автолизат в количестве 0,1-0,4% . Остальные этапы выполняют по примеру 1. Добавление в среде дрожжевого автолизата приводит к увеличению выхода чистого полисахарида до 1090 мг %, что на 185% превышает продуктивность штамма 8 на регламентной среде. При этом продолжительность ферментации штамма 23 сокращается до 72 ч вместо 96 ч, затрачиваемых на обычно проводимую ферментацию штамма 8.
П р и м е р 3. В среду Чапека-Докса вводят дрожжевой экстракт в количестве 0,1%. Остальные этапы выполняют по примеру 1. При этом дрожжевой экстракт в данной концентрации активирует биосинтез полисахарида аубазидана исходным штаммом 8 и в большей степени - штаммом 23. Продуктивность штамма 23 2099 мг % нативного аубазидана или 1144 мг % чистого аубазидана, что на 199% превышает продуктивность культуры на среде Чапека-Докса.