Способ получения антибиотика

Союз Советскитт Со циалистицесва РеспубликГасударственный квинтет Совета Мннкотров СССР по делам нзобретеннй н открытнй(45) Дата опубликования описания 09.12,77 ИностранецЮлиус Бергер(72) Автор изобретений Иностранная фирма"Ф. Хоффманн Ля Рош и Ко, АГ (Швейцария)(54) СПОСОБ ПОЛУцЕНИЯ АНТИБИОТИКА Изобрегенне относится к способам получения ан. тибиотиков путем культивирования гриба.продуцен. та на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в аэробных условиях. Известен способ получения антибиотиков с использованием в качестве продуцента гриба из рода Бтгергопусек.редлагается способ получения антибиотика путем культивирования гриба-прону цента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в аэробных условиях с последующими выделением и очисткой антибиоти.ка, при котором в качестве продуцента используют Бтгертогпусеа Бр,Х.5108, АГСС 2 386.15Ятгертогпусев Бр, Хвыделен из образца почвы, отобранной на Бермудских островах.Культура этого организма получила лабораторный индекс Бтгертогпусеа Яр. Х 5108, подкульту.ра 3191-2, была выставлена в Американской кол.лекции типов культур в Роквилле, штат Мэриленд, где эта культура была внесена в коллекцию АТСТ под регистрационным номером 21386. Виды Бтгвртопусеа, идентифицированные как Ьгертогпусеа Х, включают все штаммы Ятгертогпусев,вырабатывающие антибиотик Х.5108, котооые д могут быть дифференцированы от штамма АТСС 21386 и его подкультур,Штамм Ятгертогпусев Ьр. Х, АТСС 21386 имеет следующие особенности.Оценка степени роста.Культура дает хорошо развитый и разветвлен. ный мицелий на субстрате и характерный аэриальный мицелий на многих средах. В условиях погру. жения бактерии развиваются в виде твердых и крупных особей и в зависимости от применяемой питательной среды они могут быть бесцветными, желтыми, желтовато-коричневыми или оливково- коричневыми. Они представляют собой коричнева. то-черные пятна по краям зоны роста на агар-агаре с экстрактами дрожжей и солода.Аэриальный мицелий характиризуется умерен. ным развитием, имеет самую различную текстуру и пигментирован в серовато белый, светлый и уме. репко-серый и желтовато-серый цвет с тонкими белыми краями на ранней стадии 1 юста.Наблюдаются концентрические кольца и образование секторов из колоний. Цветные характеристики относят культуту к ряду серых, Срав. нение некоторых свойств Ятгертогпусев Яр. Х561521 19 20 грабли ца 5 Отвар из мяса с мукой и декстрин Остаток после ферментации зерна(ВУ) и декстринПрофло и декстрин 67 52 Рыбные отходы Высушенный зкстракт из зерна кукурузы вместе с растворимыми веществами561521 Таблица 6 то ытыванднв) крахмала Таблица 7 Ферменте Состав с К 1 высушенного ра.гворимого вства после экстракции зерен кукуруэы, 1 декстрина, 0,1 К, НРОи 0)1 Сасоз е. 13 1 .-глутамата натрия 1 цекстрина, 0,1 твердого веществакукурузных початков, 0.,15К, НРОн О,Оз МОБО 1 твердого веще пасты, 1 высутц вещества после кукчру.ъ, 1 ку 0,5 гпокозы, О, К, НРО,атнойастворимо из Кр 0,1 К 4,5 ")оф асворим ксгракш о", 0,5 высушенногоого вецесгва послеи зерен кукурузы, О,ешесва томатной паз мясного экстрактагон Н" 366), 1 крахмаи О, КНРО 4 твер, ки о 0,5 пась рогопе О, СаСО а, "1 рофло". 0,5 жидкости чаемой при обработке кукупочатков, ,Окукурузноо О, ГаСО, и О, К,НРО 4 ых х мала ф Ферментер объемом 454 л (" Ферментер объемом 19000;Ферментер объемом 3400 л грузка 295 л среды), изготовленный из нержавею загрузка 14500 л среды), изготовленный из угле загрузка 2220 л среды), изготовленный из утлеро дистои ста той стали 1 2 0 1 1 1 1 "Нрофло 1 0 2 1 11,0 1,0 1,0 1,50 0 0,1 СаСОз ства ток нного р экстра к куруэно СаСОз"5 1,54 149 (100) 48 Контроль АнтибиотикХ50 1,37 + 12 175 (117) 152 (100) 24 1,47 30 Контроль АнтибиотикХ - 5108 1,38 + 7 173 (1 14) 146 (100) 18 50 1,59 30 Контроль АнтибиотикХ - 5108 1,37 + 16 180 (123) 149 (100) 18 25 1,51 48 Контроль АнтибиотикХ - 5108 1,39 + 9 183 (123) 149 (100) 18 25 1,54 48 Контроль АнтибиотикХ 5108 1,41 + 13 185 (124) 149 (100) 18 10 1,54 48 Контроль АнтибиотикХ - 5108 1,33 + 14 182 (122) 18 Редактор Т.Шарганова Техред М,Левицкая Корректор С. Ямалова Тираж 53 В Подписное ЦНИИПИосударственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретения и открытиЯ13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 1694/161 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения 1. Способ получения антибиотика путем культи. вирования гриба.продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и мине. ральных солей, в аэробных условиях с последую. шими выделением и очисткой антибиотика, о т л ича ю ши йс я тем, что, с целью получения антибиотика, используемого для стимулирования роста домашней птицы, в качестве продуцента испольэунп Ятгертоптусев Бр. Х 5108, АТСС 21386.2. Способ ноп,1,отличающийся,тем,что антибиотик вьщеляют путем фильтрования куль.Составитель туральной среды, экстракции фильрата раствори.телем, не смешивающимся с водой, и последующегоизвлечения антибиотика из экстракта.3. Способ поп. 2, о тл и ча ю щи й с я тем,чтов качестве растворителя дчя экстракции исполь.зуют бутилаце тат.4, Способ поп. 1,о т л и ч а ю щ ий с я,тем, чтосырой антибиотик, выделенный иэ культуральнойсреды, очищают противоточным распределением.5. Способ поп. 1,о тли ча ю щи й с я,тем,чтоантибиотик очищают методом хроматографии,основанной на проникновении в гель сырого анти.биотика. ныделеннсзго нз культуральной среды,Р,Махнюксо свойствами других культур ряда "серых" при. ведено н табл. 1 (для всех культур поверхность спор Бгп, морфология ЙА, цвет "серый вид "),Морфология.Цети спор, образующиеся иа аэриальном мицелии, разветвляются моноподиально и симподиальио с образованием прямых цепей, петель, крючков, растянутых и имеющих неправильную форму серебристых спиралей (3-4 витка), также имеющих ме гельчатоерасположение. Цепочки бывают как короткими, так и длинными, но преимущественно они содержат болееО спор. 1 а большинстве сред наблюдается достаточная плотность. Споры удлиненные и имеют форму овалов и цилиндров, поверхность спор гладкая.Физиологин. Растворимый пигмент.1 а агар - агаре с экстрактами дрожжей и солода образун)тсн следь коричневого пигмеи)а.Культура является хромогеной (образует меланин) иа агар - агаре с пептоном и железом и тироэином, а также иа бульоне с трипто ом и экстрактом дрожжей.Культуральпые (период иикубации 14 дней при 28 С) и физиологические характеристики кулыур Ятгертод)усеь Ьр. Хприведены н табл, 2 и табл. 3 еответстнеипо.Ораиические питраты ие нослананливаются в бульоне; крахмал активно гдротизуется, а жела- типа лишь очень слабо сжижаетсн через 14 дней; хорпо усваиваются 1 арабииза, (1 фруктоза, д-л 1 аииит, 1. рампза, (1-рафф)иза и сахароза; плохо- (1-ксилоза и 1.-ииозит и совсем пе уснаинается неллю)оза.Культура Бтгертопусен Вр,хорпо развиваетсяпри 24 и 37 С, ио пе развивался при 42 или 50 С.Характер усноепия источников углерода и азотаЯтгертоп)усен Яр, Х.5108 приведен длн периодаии убации 14 0 ей при 28 С.Усвоение 1 арабишзы, (.ралпозы, .келоз ,( лаппита, 1. ипзиа, гиокзы, фруктозы, саха.розы, ацетата, пирата, малага, )кентэта, сали.пилата, сукципатз, р) рата, феплз (0,1".), раф.финоэы, крахмала, (1.рибозы, д галактоэы, (.ман.позы, цешобизы, лактэы, мальтозы, лекстрииа,пулышта, эритрита, сорбита и глицерина сстанляет1, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 2 2, 1, О, "., О, О, 3, О, 3, 3, 3,3,3,3,0,0, О, 1, О 1, а усноеиие сульфата алл 1 пия,нитрата натрии, )трита пагрия ацетамида, аснара.гина, тирозииа и О, трипзофапа 1, 1, 1, 1, 3, 3 и 2соответствен о (отрицательный контроль О.1) .Еля кулыиниронания продуцеита ЯтгертопусенБр, Хприменяют различные способы фермеитации,При ферметтации в колбах порцию спор, взятую со среза культуры на агар-агаре, ииокулируютв 100 мл питательной среды н конической колбеЭрленмейера емкостью 500 мл и инкубируютпри э 8 С на вращающейся качалке в течение 7 дней.Пробы бульона отбирают иа третий, пятый и седь.мой день. При приготовлении бо;ьтцих порций бульонапподукт ииокулиоования готовят в коническихколбах Эрлеимейера емкостью 6 и., н пигекеныхбутылях елкостью 16 л или резервуарах, снабжен.5 пых устройствами для аэрации, .отбора проб и т.д.Для аэрации через сбраживаемую среду н бутылях ирезервуарах продувают стерильный воздух. 11 рииспользовании резервуаров для дополите;ыогоперемешинания используют механические лопастО нье мешалки. Для предотнрацепия пепообра.зонания вводят аитинспецинат ели, такие, каксвиной лярд и соевое масло. Ятгертогпусен Ьр.Х.5108 культивируют в различных жидких средах,предпоч пастельно н среах, содержащих источпик5 ассилплируелого у лерода, например крахмал,глюкозу, мелассу, и истошик ассимидируемогоазо)а, таки, к;к елки, ид)лзаы белковолипептид , алип кис:оы, )лздк ость, иолу.чае мук) при обработке ку курьезных початков,го по диамеру зпы ингибиронапия грамполо.жэтелыых бакерий Вас 11 н. илп Вас 11 ньйпр(ех )б)ьппьл метм диффузии н:реде агар .нашк й и ппа спикй,Припимают условно, по актинпсть аптибиоги.каелмл раснора соответствует диаметру зоны30 ин ибпрвалин0 мм. Кулыуру испытуемоголзкроор апизма выращивают н питательполбульпе, папример н бульоне с трилтиказой и соей,в ечепие 24 42 час при 28 С иа нратаощейсн ка.чалке (100 мл среды в кошческой колбе Зрлеи 35 меиера емкостью 500 мл). 4 мл выраценной куль.туры (копие) трасия 0,25 - 0,5",) напинают пазастывший ппаельпый с;ой агар-иара н чашках1 ери, мешаот их н холщшыпк по меньшей мерепа 2 час до опюра и заполнения испытуемым40 растнорол, содежащим антибиотик, затем ипкуби.оруют 18 час и)и 35 С и измеряют диаметр золыи гибирванин с тшстью до 0,5 мм. Активностьантибиотика вычисляют по стандартным кривым.,ля производства антибиотика целесообразноиспльзонать сложпые азотсодержащие вещества,паприлер, растительпого (соеные бобы или хтопко.ван мука, овсяная мука, твердое вещество томатной пасты, растворимые вещества, образующиесяпри ферментации зерна) или )ювотпого (рыбиая50мука, отвар из мяса с мукой, продукты гидролизааминокислот) происхождения и микробиальиыеклетки (дрожжи "торула ).Источниками углерода служат, например, глюкоза,глицерин, декстрии и кукуруэсый крахмал. Кроменеорганических солей, обычно входящих в составприродных сред, вводят другие соли, такие, какфосфат калия, карбоиат кальция, сульфат магния, имикроэлелеить,Целесообразно для производства антибиотикаХ 5108 в ферменты загружать среду, содержащую1% обезжиренной муки из семян хлопка (" Профло"),0,5% концентрата жидкости, получаемой привыщелачивании кукурузы, 1% кукурузного крахмала, 0,1% гидрофосфата кальция Кз НРО 0,1%карбоната кальция СаСОз.В табл. 4 показано влияние состава питательнойсреды на выход антибиотика Втгертогпусез Бр.Хпри проведении опыта во встряхиваемыхколбах (период инкубации 5 дней).Все среды содержат 1% декстрина, 0,1%Кз НРОа, 0,1% СаСОз и 1% источника азота.В каждые 100 мл среды для инокулированиявносят 1 мл суспензии спор Втгертогпусез Яр.Х.Результаты, полученные при выращиванииВтгертопзусез Вр. во встряхиваемых колбах в течение 4 дней на средах, содержащих 0,1%КзНРО 4,0,1% СаСОз и компоненты, указанные втабл. 5 (по 1% каждого), приведены в табл. 5. Дляинокулирования 100 мл каждой среды употребляют 1 мл суспензии спор Втгертогпусез Яр. Х.5108.Влияние состава питательной среды на выходантибиотика Втгертопзусез Вр. Хво встряхи.ваемых колбах и в аэрированных резервуарахотражено в табл. 6.При ферментации в различных аппаратах получают результаты, сведенные в табл,. 7.Каждая среда содержит 0,5% СаСО, и 0,1%КзНРО 4 Для определения активности антибиотикаиспользуют Васцз згпр 1 ех.Продуцент Бтгертопзусез Вр. Храстеттакже на некоторых химических синтетическихсредах, содержащих аммониевые соли, нитраты илиаминокислоты (глутамат, аргинин, глицин), служащие источниками азота, глюкозу, декстрин,крахмал, цитрат, ацетат и т.п., служащие источниками углерода, с добавкой солей, таких, какфосфат калия, карбонат кальция и сульфат магния,и микроэлементов, включающих двухвалентныеионы железа, меди, марганца, кобальта и цинка.Результаты ферментации Втгертогпусез ВрХна различных синтетических средах пока.заны в табл, 8,Выход антиоиотика Хувеличивается прихорошей аэрации среды. Антибиотик Х.5108 можнополучать при любой температуре, обусловливающейудовлетворительный рост микроорганизма. Так,налример, при выращивании Втгертопзусез Вр.Х 5108 в колбах при 24,28,30 и 32 С(анализ навыход антибиотика через 3,4,5 и 6 дней) выходантибиотика достигает максимума через 5.6, 4, 3-4и 3.4 дня соответственно.Во время ферментации среда остается почтинейтральной или становится слабо кислой, Конечнаявеличина рН зависит от наличия буферных веществи от первоначальной величины рН среды (средадолжна быть нейтральной до стерилизации) .Для выделения и очистки антибиотика Х используют различные способы, например, экстракцию растворителем (периодическая или непрерыв 1 О 152530 3545 50 стацдарт тетраметнлсилан): отчетливые сигналы при 0,92, 1,66-2,03, 3,16 и 3,43 8 и в области сигналов олефинов.Микробигяцную активность антибиотика Хопределяют методом с чашкой и пластиной,с диффузией в среде агар-агара. ная противоточная экстракция), проводимую в экстракционных колоннах, и хроматографию, основанную на проникновении в гель сырого антибиотика, выделенно о из кулыуральной среды.Из культуральной среды антибиотик Х. 5108 вьщеляют путем отделения мицелия фильтрованием или центрифугированием с последующей экстракцией фильтрата или фугата несмешивающимся с водой сложным эфиром, например этилацетатом, амилацетатом, бутилацета том, предпочтительно, бутилацетатом, при рН 3-7,5.Для противоточной распределительной экстракции используют смесь этилацетата, изопропанола и 0,1 н. водного раствора Каз НР 04.Для окончательной очистки антибиотика Хприменяют метод хроматографии, основанный на проникновентп 1 в гель предварительно очищенного экстракш 1 ей препарата, на геле декстрана с поперечными связями или на полимернзованномгеле декстрана,Для хроматографии берут "сефадексН.20" иэлюируют спиртом. После отделения антибиотика фильтрованиемили центрифугированием культуральной среды егоанализируют методом тон кослойной или бумажнойхроматографии при проявлении пятен методомфлуоресценции и биоавтографии. Для хроматогра.фии лучше использовать стеклянные пластины,покрытые силикагелем.Для тонкослойной хроматографии используют смесь хлороформа, метанола и гидроокиси аммония,После очистки антибиотик Хпредставляет собой аморфное желтое вещество.Найдено, %: С 63,63; Н 7,81; Ы 3,48; О 25,08 (по разности).Антибиотик Храстворим в спиртах, например метаноле, этаноле, 1 и 2 -пропаноле,трет-бутаноле; в несмешивающихся с водой сложных эфирах, например в этилацетате, амилацетате,бутилацетате, и в хлороформе.Антибиотик не растворим в воде.ИК- спектр, см : 3400 (широкая),660Антибиотик Хобладает низкой токсичкостью нрц оральном и парэнтеральном введении, значительной активностью против, стрегггококков при систематическом (орал ьном) и местном (подкожном) введении, активностью против пневмококов и кишечного кокцидиоза, При опытах на мышах установлено, что антибиотик практически не токсичец при оральном и подкожном введении (ъ.О; е це более 2000 и 1320 мг/кг соответственно), Антибиотик активен при оральцом (1 О, е 52 мг/к 1.) и подкожном (Сд,е 44 мг/кг) введении против Бтгертососсоа руоцпеа, активен против 01 р 1 ососсиз Рпеоггоиае (СДе 807 и 283 мг/кг прн оральном и подкожном введении соответственно) и против грамотрицательных бак терий,Антибиотик Хпри введенив корм домашней ит)1 ы стимулирует рост послешчейОоычцо антибиотик Хдобавляют к сба.лансировавьм в отношении питательности кормам для доашьей птицы (ца 100 вес.ч. корма -0,0001-0,01 вес.ч. антибиотика) . Даэьцеицее увеличение коццец.:рации ацтибиоика це приводит к УЛУЧШЕЦИЮ РЕЗУеътатОВ.П р и м е р 1. Сусиензией спор Бтгертогиусва Бр. Хиз пробирки с 1 гитательной агар-атаровой средой ицокупируют содержимое резервуара из иирекса емкостью 16 и, снабженного прспособ. пением цля аэраци, в который загружено 15 л сред, содержа 1 ей (в %): 1 севой мукп,желтого сахара,0,2: твердого вещества, получаемого ири переработке кукурузных початков, О, К, НР 04, 0,1 Са(Оз и 0,05 свиного жира (ацтцвсие.ватель).Период ицкубаци 4;оя ири 28 С в усповях аэрации. Выроспий волокшгсгый материал пере. носят и фермеггер емкостью 378 и, изготовленный из нержавеющей лали, которы содержит 192 и среды з Л обезжиренной муки из семян хлоичат. ника, 1 Я кукурузного крахмала, 0,25% твеэцого вепаства, иолу гаемого ири переработке куку. рчзцьх початков,0,1% СаСО О,Л К 2 НРОч 0,5% свиного жира.рН среды до ицокупировацыя 6,8. Фермецтер аэрируют и через 5 дней вьиружаюг содержмое, фипьгруюг с иэиоцьзовацием диагомцтовой земв, иоцкисляют фильт 1 эат до рН 3,5 экс 1 ра ируют его вдвое меньшим объемом бутилацетата, осветленцый экстракт концентрируют в вакууме ири темпе. ратуре ниже 40 С до образования коричневого сиропа, после рьлирация коорого с петролейным эфиром выделянэг твердый порошок антибиотика Х.5108 с активцостьн против ВасНоа Е, 120 ед/мг.П р и м е р 2. Антибиотик Х.508 очищают путем периодической экстракции растворителем. Партии куртуральцой среды после ферметани (11340 л), котоэые ири испытаниях пНго пока. зывают активность м 130 ед/мл против Вас 1 оа агпрех, фильтруют, экстрагируют фильтрат бутипаце татом ири рН 7,5, промывают экстракт водой, коццентряруют методом м 1 ковецкого исиа. рения при температуре ниже 50" С, прибавляютмалонат диэтилнатрия до рН 9,0, образовавшийся же:1.тый осадок отфильтровывают иромываюг бутцаиста.том, обраба 1 ывают смесью вода. бутила це 1 а и . 1 ов оця 1рН до 4. Органическую фазу отделяют, обраоагы.вают, как указано выше, цо малонат диэтилнатрияприбавляют до установления рН)5. Получешыйосадок подкисляют, экстрагируют свежим бутц;1.ацетатом, обрабатывают экстракт "дарко 6.60" инатриевую соль антибиотика Хосаждаютприбавлением малоната диэтилцатрия до рН 8,0.Образовавшуюся желтую натриевую соль антибиотика промывают и сушат. При испытаниях гпч 1 тго активность соли 430 ед/мг против ВасНаагир 1 ех.Технологическая схема выделения ац гибиотикаХ.Стадия 1. 11340 л бульона в цепом сбор че.рез 5-6 д 1 ей) фильтруют.29 Стадия 2, К 9804 л профильтроваццоо бульона(рН 7,5) при необходимости добавляю 1 Н,РО 4 иэкстрагируют 2268 л бутилацетата.Стадия 3. 2192 л экстракта промывают 2 х 94 лводы и концентрируют методом мгновенного испа.рекя,Стадия 4. К 302 л концентрата прибав,яютмалоцат диэтилнатрия до рН 9 (-1 1,5 л 1,7 ц.раствора мапоната), осадок отфильтровывают ипромывают 3,7 л бу гилацетата.зо Стадия 5. Попучеццый осадок растворяют в 94 лводы, добавляюг 15%-цую Н, РО до рН -4 и экстрагкруют двумя порциями бутилацетата (75 + 37,8 л) .Стадия 6. 106 л экстракта промывают 2 х 7,5 лводы и концентрируют методом мгновенного35 испарения.Стадия 7, К 15 л концентрата прибавляютмалонат диэтилцатрия до рН 8,5, отфильтровываютосалок и п)юмывают 3,7 л бутилацетата.Стадия 8. Выделенный осадок растворяют в 75 и40 воды,цовоцятрНдо 5 с помощью 5% ной Н РО изэкстрагирунэг двумя порциями бутипацетата (56,7 +28)3 и).Стадия 9. 78 л экстракта промывают 2 х 7,5 лводы и концентрируют методом мгновенногоисиареция,Стадия О. 5 л концентрата перемецтивант с 50 г. . .дако С.60 в течение 1 час при 1;омцатнойтемпературе, фильтруют и концентрируют методоммцовеццого испарения,50 Стадия 11. К 7,5 л концентрата прибавляютмалнаг циэтилцатрия до рН 3,0, отфильтровываютосадок, промывают 3,7 л бутилацетата, затем 3,7 лпетролейцого эфира (т. кин. 3(160 ), сушатопри 56 С/11,5 мм в течение 36 час и получают натри55 евую соль антибиотика Х 5108 в виде желтогоаморфного вещелва,П р и м е р 3. Очистка антибиотика Х иротивоточной распределительной экстракцией причисле труб 00, объеме верхней и нижней фаз 40 мл60 (каждая) .95 г антибиотика Х, выделенного экстракцией из сырого бульона после ферментации, растворяют в 40 мл верхней фазы и используют систему эгилацетат - изопропанол 0,1 М йаэ НР 04 (12:9:20 по объему). Число переносов 200, пик для труб после 200 переносов 159, коэффициент распределения 3,88.Фракции 150-170 собирают, к экстракту антибиотика в органической фазе прибавляли 1-бутанол, водную фазу отбрасывают, органическую промывают четырьмя порциями воды, воду оттоняют в виде азеотропа, прибавляют петролейный эфир и выделяют 3 г антибиотика, активность которого в 2 раза больше активности исходного материала.П р и и е р 4. Для очистки антибиотика Ххроматографией на сефадексе 1.Нк этанольному раствору 300 мг пробы антибиотика, предварительно очищенного противоточной распределительной экстракцией, добавляют раствор метилата натрия (влажная индикаторная бумажка) до рН 8-9, вносят в колонку с сефадексом Н(290 х 41 мм), уравновешенную спиртом ЗА. Колонку проявляют спиртом ЗА и антибиотик удаляют из колонки в виде раствора объемом 950-1200 мл (активные фракции) . Последующие фракции содержат ряд окрашенных зон с незначительной биологической активностью. Активные фракции сливают, выпаривают до небольшого объема, при. бавляют к остатку эфир и петролейный эфир и осаждают антибиотик в виде желтой натриевой соли, дающей только одно желтое пятно при тонкослойной хроматографии (силикагель Е 254, обна. ружение в УФ- свете) с й 0,29 (силикагель/кизель. гур, биоавтография). 11 р и м е р 5. 0,464 г натриевой соли антибиоти.ка Х 5108, полученной хроматографией на сефа.дексе Н.20, растворяют в 4,6 мл ледяной воды, прибавляют 1 О мл этилаце гата, переносят в делительную воронку и прибавляют 1 мл раствора Л 1 антРО (50 г л 1 аНэ РО 4 ф Н, О в 100 мл воды). Образовавшийся вначале осацок растворяется при встряхивании. Орга. ническую фазу промывают четырьмя порцй. ями ледяной воды (по 1 обьему), отгонявя от нее азеотроп, разбавляют концентрат (2 мл) 2 ,объемами этилацетата, прибавляют диэтиловый эфир ио каплям до помутнения и вводят 30 мл10 10 петролейного эфира. Полученный осадок анти. биотика Хотфильтровывают н сушат при комнатной телшературе.П р и м е р 6. Основной рацион готовят иэ следующих ингредиентов (вес.%): Измельченное желтое 56,075 зерно кукурузыМясо и костнаямука (50% белков) 4,000Рыбная мука(50% белков)Дегидра гированнаямука из альфа альфы 1.000Животный юр 4,000Метионин О,"ООМи не раль ный ф осфа т 0,250Карбонат кальция 1,200Иодированная соль 0,250Витамины 1,000Минеральные компоненты 0,025К этому рациону прибавляют антибиотик Х. 5108в норме 50 г антибиотика на 1 кг рациона.Проводят опыт путем непринудительного кормле.ния домашней птицы (однодневные цыплята) рационом с добавкой антибиотика Х. 5108 в течение 15 дней.Затем цыплят взвешивают, учитывая количество съеденного корма, и эффективность кормления опреде.ляют путем сравнения с контрольными группами.Средний дополнительнъгй привес цля каждой опыт.ной группы делят на средний привес контрольной группы и частное умножали на 100.Привес за 2 недели (среднее значение для 40 цыплят) для контрольной и испытуемой (50 г антибиоти.ка на 1 кг рациона) группы составляет 154+ 8 и 185 Т12 г (с учетом среднеквадратичной погрешности длясреднего значения), или 100 и 12 соответственно,Эффективность кормления 1,55 и 1,39, улучшение эф.фективностн кормления12%,28,000 При введении в рацион различных количеств антибиотика Х. 5108 получены результаты, указан. ные в табл. 9. 45 Из данных табл. 9 видно, что цыплята, полу. чавшие рацион с добавкой 50 мг антибиотика Хна 1 кг рациона, растут быстрее, чем в контрольной группе.561521 Таблица 1 Свойство Образованиемеланина Образование антибиотика Стреп. толин Источник углерода Глюкоза д- Ксилоза 1 Араби коза1. Рамноза% МТо же Аспарагиндекстроза.0,25% Отсутствует От оранжевого до канарееч.но. желто. го д-Фруктоза д-Раффинозад. Маннит Х Олеан- Хлор- Гри зе. Анти.домн. тетра. олуте- трихоцин циклнн ин монас Аэриальный мице.лий беловатый;спорообразованиехорошее; споры белые Аэрнальный мице.лий от сходного с пушинками до порошкообразного, белый, становится при спорообразовании дымчато. серым(ВВ 1) Слабо- темный Отсутствие спорообразования Светло. желтый Питательный Темный То же агар-агар сэкстрактомдрожжей Агар-агар с глицерином От удов. летвори. тельного Влажный, кремоватого цвета Отсут. ствует до хорошегоГ 10 дн й) Отсутствие спорооб раз ованияТо же,Мерный ХорошийТо же Хороший рост на всех перечисленных жидких средах, бульоне с триптоном (темный пигмент,отрицательная реакция на индол через 3 дня); питательном бульоне ГДА, бульоне Чапека с сахаро.зой, бульоне Краинского с глюкозой и бульоне с глицерином и цитратом кальция.Хороший рост в течение 8 дней при 24, 28, 32 и 37, но не при 42 С. Агар-агар спел тоном нтоматнойпастой Агар. агарКраннскогос крахмалом,глюкозой Тампон изкартофеляТампон нзморкови Аэрнальный мицелнй от белого досветло-серогоспорооб разованиехорошее; споры серые Спорообразованиехорошее, спорыстановятся дымчато-серыми с белымикраями Аэриальный мицелий белый; споро- образование хорошее; споры становятся дымчатоОт серовато.го до жел.товато ко.ричневогоСветложелтый561521 15 То же 13 12 14 дается 3 1 О Бульон с органи.ческнм нитратом 8 Желатина (15%)при 18 С Агар- агар спептоном и железом (Клит. лер) Лакмусовоемолоко Яичный агар ДорсетаУмеренный, безспор Хороший, темныйпигмент Удовлетворитель.ный, темный раст.воримый пигмент От удовлетворительного до хорошего; коричневато черныйпигмент, отсутствие спор Хороший, слабое спорообразование Удовлетворительнь й поверхностный рост Удовлетворитель.ный поверхност.ный рост; отсутствие слорообра.зования Хороший; слабоеобразование бе.лых спор Очень хорошийрост; в основномхорошее образова. ние светлосерых спор 16Таблица 3 Восстановления нитрата не наблюдается, га.зов не образует.ся Сжижения желаткныне наблюдается ф лабое сжнжение Хромогенная . образуется меланин Цвет лакмуса не меняется; помут. кения или осветления не наблюСветло. коричневатый цвет; отсут.ствие помутнения или осветления Небольшое коли "чество темно.го пигментаБф 1521 18 Таблица 4 Активность антибиотика е мл Источник азота Отвар иэ мяса с мукой 50 ВУ - 100 ("Коммершиал СолвентсКорпорейшен" ) 45"Сойалоз" (обезжиренная му.ка соевых бобов)Белковая мука из арахиса 30 41 Белковая мука из кокосовыхореховТвердое вещество томатнойпастыМука с льняным маслом 50 57 37 Кукурузная мука 33 Высушенный экстракт из зернакукурузы вместе с растворимымивеществами (Х. Уоркер) 74"Солудри" ("Шинли Дистиллерс")Рыбная мука (Гортон)Рыбные отходы (Уилкинсон) 51 25 16 Смесь молочного сахара саль бумином 50 Высушенные дрожжи "торула" 38 Автолизат дрожжей "нейшенел" Гидролизат сои, образовавшийсяпод действием энзимов 33 12 Гомогенизированная отжатая рыба 27 Протопептон Нф 366 (" УилсонЛаборато риз") 18 Твердое вещество кукурузных початков 26 Период инкубации о дней.Концентрация источника азота 2 %,Гидролизат белков пшеницы,образовавшийся нри кислотном гидро.лизе ("Турок Миллз")