Патентно-техннескаябиблиотека

О П И С А Н И Е 287650ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ ависимыи от патентаЗаявлено 12.Х 1968 ( 1283268/30 Кл. 53 д, 4/04МПК А 231 1/175УДК 631:244.6(088 Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР,Х 1,1970. Бюллетень3 публиковч а опубликования описан 1 я 21.1,19 Авторыизобретени Иностранцы жиованни франчески (Италия) и Арпад Грейн (Авст Иностранная фирма сСосиета фармасеутикиСЕССОЗНАЯ т1 ч.Д-ЦЩЩДИБЛИОТЕКА явител СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОРЕНИЕРАТЕНА И ЕГО 3-ОК И З,З-Д И О К С И П Р О И 3 В ОД Н ЪХИзобретение относится к способам получе. ния химических соединений, в особенности и способам получения соединений с использованием бактериальных культур.Известен способ получения изорениератена и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводных с помощью химического синтеза. Однако известный способ довольно сложен и, следовательно,требует больших затрат,С целью упрощения технологического процесса предлагается получать изорениератен и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводные биологическим путем с использованием культуры гриба Ягер 1 огпусез гпейо 1 аш (штамм 2215/74 1" .1, из Коллекции штаммов Фермиталия). Штамм также депонирован в Институте фитопатологии при Миланском университете под1,Р,т/, 1952 и в Международном микологпческом институте под1.М.1. 134886.Ниже дано описание мор фологически и культурных признаков этого гриба,А. Вид под микроскопомНа простой культуральной среде вегетатнвный мицелий в виде более илн менее тонки гифов толщиной 0,4 - 0,9 мкл с многочисленными длинными разветвлениями, которые образуют более крупные гифы толщиной 1 - 1,3 мкм, длинные и переплетенные. Из этих ги. фов моноподиально ответвляются гифы, образующпе споры плп спорофоры, которые сильноплп слегка вьются, длинные, образованные малыми цепочками спор, которые вначале связаны, затем свободны. Споры гладкие, чаще ку 5 бической формы, иногда также цилиндрической и округлой формы. Под микроскопом онпвыглядят в виде арактерныкубиков размером (0,9 - 1,1) Х (0,9 - 1,1) лклю.Б. Микроскопический впдВ табл, 1 приведены культуральные свойст.ва на среда., в которы 8. птейо 1 ап 1 выращивался прп 28 С, причем наблюдения были проведены на З-й, 8-й, 15-й и 20-й днп после пно 15 куляции,Гриб проявляет быстрый обильный рост собразованием компактного твердого вегетативного мпцелпя в виде ровной патины, окрашенной в цвета от яично-желгого до оранже.во-желтого. Воздушный мнцелпй, также обильный на всей культуральной среде, довольносож по виду с лопком, окрашен в цвета отванильно-желтого до гвоздично-желтого. Значительных различий между грпбамп, выросшими на синтетической и органической средах,не обнаруживается.В. Биоимическпе свойстваПротеолиз желатины - реакция положитель.ная. Превращение нитратов в шггриты - реак28765 О ТаблицаВозушный мицелий Вегетативный мицелий Рост Среда Обильный хлоп ковидпый, ванильно-желтого цвета с бежевыми и розовыми опенкамиОбильный, хлопко видный ванпльно-желтого цвета с бежево-серыми оттенкамиумеренный, ровный ваниль- но-желтого цвета Обильный, в видеровной патины Яично-желтый или абрикосово-желтый с обеих сторон Агар Беннета Умеренный, в видеровной патины От лимонно-желтого до абрикосово-желтого цвета с обеих сторонЛимонно-желтого цвета с обеих сторонАбрикосово-желтого цвета с обеих сторон Агар Чапецкого Обильный, в виде ровной патиныОбильный, в виде слегка складчатой патины Аспарагино.глюкозовый Обильный, хлопковидный от розово-желтого до почти бежевого цвета Глицерино-глициновый агар Обильный, в видескладчатой патины Скудный, ровный, беловатокремого цветаОбильный, хлопковидный от гвоздично-желтого до светло-бежевого цвета Агар )мерсона Апельсиново. желтого цвета собеих сторон Лпельсиново.желтого цвета собеих сторон Обильный, в видеровной патины Крахмальный агар и соли Обильный, в видеровной патины Обильный от пылевидного до хлопковидного, гвоздично- желтого цвета со светло.бежевыми оттенками Апельсиново-желтый с обеихсторон Картофельный агар Обильный, в видеровной патины Обильчый, довольно ровный, пылевидный, розово-желтый порошокОбильный, хлопковидный от гвоздичного до светло.бе- жевого Овсяный агар Светлый оранжево-желтый собеих сторон Аспаргино-глицериновый агар Обильный, в видеровной патины Оранжево-желтого цвета собеих сторон Обильный, в видеровной патины Обильный, слегка хлопко. видный, от ванильно-желтого до светло-бежевого цвета Агар глюкозо.дрожжевом экстракте Глубокого оранжево-желтогоцвета с обеих сторон Обильный, в видеровной патины Крахмало-пептоповый агар Обильный хлопковидный, от желтого до светло.бежевого цвета Оранжево-желтый с обеихсторон Обильный, в видеровной патины Агар на смеси пептона с нитратом калияУмеренный, розовый, ванильно-желтый с гвоздичными оттенками Светлый оранжево-желтый собеих сторон П р и м е ч а и и е, Растворимый пигмент отсутствует при выращивании па всех средах,цня положительная. Крахмал гндролизуег. Молоко не коагулирует, но пептоннзирует. Меланин не образует. Тирозин разлагает, Образует нерастворимые пигменты.Используют следующие источники углерода: глюкозу, 1-арабннозу, сахарозу, И-ксилозу, дманннтол, д-фруктозу, мальтозу, рамнозу н глицерин; мезоннознтол и раффннозу не используют.Гриб не растет при 50 С н не образует склероций. Погруженная в воду и взбитая культура образует изорениератен, 3-окснизорениератен и 3,3-дноксинзорениератен. Г, Идентификация грибаСвойства, проявляемые грибом и описанные выше, позволяют отнести его к роду Ягер 1 огпусез Юасзгпап е 1 НеЬпс 1 (Вегэеуз Маппце о 1 Эе 1 егпппа 1 же Вас 1 ег 1 ооду, 1957, стр. 774 - 775), По РгЫгпап е 1 а 1, он принадлежит к 1 хес 1 цз НехЬ 11 з группа желтых (Арр. гп 1 сгоЫо 1 6, 1958, стр, 52),Цвет вегетативного и воздушного мнцелня не позволяет отнести его к какому-либо из известных подвидов, предложенных ЮаЬпап, Ва 1 йасс 1 е 1 а 1., Сацзе е 1 а 1., аар е 1 а 1., ЕШпдепег е 1 а 1.4 б Сравнение свойств рассматриваемого грибаи известных показало, что ни один нз последних пе имеет всех тех свойств, которыми обладает рассматриваемый микроорганизм. б 0 Отсюда следует, что рассматриваемый микроорганизм не может быть идентифицирован с каким-либо видом, описанным в литературе, и поэтому его следует рассматривать как новый вид, Ему было дано название с 1. гпейо 1 ап 1.55 Он может быть размножен путем ннокуляций на твердой среде или путем лнофилнзацни суспензии опор в молоке.Согласно изобретению способ заключаетсяв кулыпвированни Я. тпейоап в погруженной 60 культуре, в культуральной среде, содержащейисточники углерода, азота и минеральных элементов, В частности, микроорганизм культивируют на жидкой культуральной среде в аэробных условиях при температуре 24 - 37 С, 65 предпочтительно при 2 С в течение 72 -160 час р 11 можно варьировать в зависимости от среды от 6 до 8.В качестве источника углерода могут быть использованы применявшиеся и ранее глюкоза, декстриц, крахмал, различная мука - кукурузная, соевая, пшенцчная, кукурузный настой и т. дИсточником азота, помимо указанных вьгше источников углерода, содержащих также азот, могут служить казеин, размолотые семена 10 хлопчатника, соли аммония и т, д.Минеральные соли, пригодные для приготовления каротецоидов, вносят в зависимости ог применяемой среды.15Например, могут быть применены обычно употребляемые хлориды, сульфаты или фосфаты натрия, калия, магния, цичка, меди и кобальта, карбонат кальция и др. Фермептацшо можно выполнять лабораторно в колбах пли в 20 промышленных ферментерах различной мощности. По окончании ферментации мицелий отделяют от культурального бульона путем фильтрования или центрифугирования, а пигментные продукты выделяют путем экстраги рования соответствующим органическим растворителем, смешивающцмся или несмешивающимся с водой, таким как метанол, хлороформ, ацетон или метиленхлорид. Разделение каждого продукта осуществляют с помощью 30 хроматографии по известной технологии.Продукты, полученные предлагаемым способом, были известны и ранее и применялись в зоотехники с целью получения яиц домашней птицы с более ярким желтком. Эти соеди нения дают птице в виде добавки к кормам. В данном случае может применяться мицелий, полученный в процессе ферментации, а не только чистые соединения.40Если применяют мицелий, выделенный из культурального бульона, то его высушиваот в горячем воздухе или в вакууме и затем размалывают.Полученный таким путем порошок тщатель но перемешивают с обычными кормами. Количество пигментного продукта, добавляемое в пищевой продукт, может меняться в зависимости от нужной пигментации и в соответствии с выбранным количеством натуральных пиг ментных элементов, предпочтительно оно может составлять от 0,3 до 6 г на 1 гг кормов,Пигментационное действие продуктов, полученных предлагаемым способом, было опреде лено по интенсивности цвета желтков, измеренной по колориметрической шкале Косгге (Ма 1 пдцу Р. е 1 а 1.).Опыт был проведен на 30 курах-несушках 60 семимесячного возраста, размещенных по отдельным клеткам и разделенных на три группы по 10 штук в каждой.Группакур 65 Состав корма 1 Основная диета, содержащая небольшоеколичество общих пигментов, соответствующее 13,89 лгг на 1 кг корма.2 Основная диета - ,-обезвоженная люцерна+общие пигменты 1500,ца на 1 ггсмеси.3 Основная диета+мицелий с содержагшемобщих пигментов 1500 лгг ца 1 гг смеси.Состав основной, диеты, вес, %:гибридная кукуруза 39,0 овес 17,6 пцгеиичиые отруби 12,0 соевая мука 44%-ная 15,0 мясная мука 3,0 рыбная3,0 концентрат дрожжей 1,00 г 11-метионин 0,1 фосфат натрия 0,7 карбонат кальция 6.30 хлорид натрия 0,3 свиной жир 1,0 фэркомплекс (фирменньшпродукт) 1,0Фэркомплекс - ссэлементов, имеющая состав (на 1 кг смеси), г;защищенный витамин А, м. ед 750,000Д, м. ед 150000Е, и. ед. 500витамин В 0,4В 12 0,0024К 0,1Р 2,5фолиновая кислота 0,015 д - кальция паитотенат 1 Н - метиоиин 40 колшгхлорид 100 хлортетрациклиигидрохлорид 2 иодин 0,1 марганец 7 цинк 5гидроксиб тиотол ол 1 О неизвестные факторы роста до 1,000 В уг 1 омянутых группах 2 п 3 обезноженную люцерну и мицелий заменили аналогичными количествами пшеничных отрубей. Опыт, длившийся 30 дней, был разделен на два периода:предэксиеримецтальцый период (10 дней), когда кормление проводили в соответствии с основной диетой, це содержащей люцерну;экспериментальный перцод (19 дней), когда кормленце проводцли так, как описано выше.Во время экспериментального периода и в последующие дни была определена пигментация желтков. Результаты приведены в табл. 2.Следующие примеры иллюстрируют изобретение.П р и м е р 1. Спорулированный слой десятидневной культуры Я. гпейо 1 ап 1, выросшей в пробирке на агаре-картофельном глюкозате при температуре 28 С, сняли и собрали в 4 лгл стерилизовацнои дистиллированной воды.получгглга 1 ггл куль как в прп 0,3 0,4 7,0 1,20,75 2,35 100 цл получили1 лл кулькак в при 4,0 1,0 0,5 цл этой суспензии пспользовалгг для ггггокулирования колбы, емкостью 300 игл, содержащей 60 цл среды следующего состава, %:декстрин 4,0 казеин 1,0 карбонат кальция 0,5 сульфат аммония 0,1 бикалийфосфат 0,01 настой кукурузы 1,0 сырая вода до 100 ггл Стерилизацию проводили нагреванием в автоклаве при температуре 190 С в течение 20 цин. После стерилизации р 1-1 соеды составил 6,9. Колбу ипкубировали при 28 С в течение 26 час на роторном вибоаторе с числом оборотов 225 об/,цин и ходом 3 с,ц, 2 цл полученной таким путем культуры использовали для ппокуляции колбы емкостью 300 цл, со. держащей 60 цл той же самой среды, стерилизованной так, как описано выше. Инкубацию проводили в уже оппсанныусловиях, После 120 час ферментации получили 500 ггкг пигментныпродуктов на 1 лл культурального бульона. МинимальныйМаксимальный Срсдний результатП р и и е р 2. Процесс такой же,мере 1, с той лишь разшщей, что вследующего состава, %:нерастворимый крахмалсоевая мукакукурузный настойхлорид натриякарбонат кальциясырая вода доПосле 120 час фер мента цип600,цкг пигментных продуктов натурального бульона.П р и м е р 3, Процесс такой же,мере 1, но среда имела состав, %:глюкозамука из семян хлопчатникарастворимый крахмалкарбонат кальциясульфат аммониякукурузный настойсырая вода доПосле 120 цас ферменгацгш900 лгкг пигментных продуктов натурального бульона.Пр и мер 4. Процесс такой же,мере 1, но среда имела состав, %;растворимый крахмалказеин 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 соевая мука 3,0 мела сса 0,2 карбонат кальция 0,4 сульфат магния 0,1 сырая вода до 100 цлПосле 69 час ферментации получили 600,цка пигментных продуктов на 1 цл бульона культуры.П р и м е р 5. Три колбы на 300 цл каждая, содержащие среду, описаннуго в примере 1, инокулировали 25-дневной культурой, выраженной на среде и в условиях, описанных в примере 1. Эти колбы инкубировали при температуре 28 С в условиях, описанных в примере 1. 170 ял культурального бульона, полученного таким образом, инокулировали в 3000 лиг той же самой жидкой среды, содержащейся в пятилитровом ферментере, снабженном винтовой мешалкой, переливной трубкой для указания на кипение, барботером, трубкой для ипокулпрования, трубкой для отвода воздуа и термометром.Процесс осуществляли при температуре 28 С со скоростью аэрации 3 и/лин и при перемешивании со скоростью 400 об/лсин. Во время ферментации вспенивание регулировали путем добавления в малых количествах кремниевого пеногасителя.Максимальный выод пигментных продуктов получился через 77 час ферментации и составил 50,цкг на 1 цл культурального бульона.10 л культурального бульона фильтровали 2%-ным Хафле Суперцел (торговое наименование), фильтрат отделили, Мицелий суспендировали при комнатной температуре в 3 л метанола и взбалтывали. Затем каждый раз экстрагировали 3 л смеси метанола с хлороформом (1:1). Объединенные экстракты повторно промывали водой и выделенный хлороформенный слой высушивали герез сульфат натрия и выпаривали в вакууме при 35 С. Темно-красный маслянистый осадок состоит из комплекса пигментов - пзорениератенов. Этот осадок отбирали петролейным эфиром (300 сца). Вес красно-коричневой массы, отделенной фильтрованием, составил 1,5 г.Маточные эфирные растворы концентрировали до 100 лл и хроматографнровали на колонке с нейтральной окисью алюминия сначала элюированием петролейпым эф гром, чтобы удалить жиры, затем петролейным эфиром, содержащим 1% ацетона, Элюат из большого верхнего слоя концентрировалп в малом объеме и выдерживали ночь в холодильнике. Выделили 400 лг пурпурно-красного кристаллического продукта с точкой плавления 200 - 201" С; хгаг(симальггая адсорбция в видимом спектре при следующих длинах волн (фракция А):растворительпетролейный эфир (428), 448, 479;бензол (440), 65, 495.Путем роматографирования через тонкий слой силикагеля было найдено: К 1=0,85 (бен(438), 463, 4 оЗ. растворительпетролейиый эфирбензол 7 ни раствор ительпетролейиый эфирбензол(425), 446, 475; (438), 463, 493,Корректор Л. Л. Евдонов Заказ 8939, 8 Тираж 480 Подписиог ЦИИИПИ Комитета по делам изобретеиий и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раугпскав иаб., д. 4/5 Типографии, ир. Сапунова, 2 зол) и К 1=0,38 (петролейный эфир с 1% ацетона). Эта фракция А поэтому были индентифицироваиа как изорениератен путем хроматографического и спектрографического сравнения и по точке плавления в смеси с образцом, приготовленным путем синтеза. Осуществляя элюирование колонки петролейным эфиром, содержащим 10% ацетона, собрали второй слой; из элюата, сконцентрированного до малого объема, получили 200 иг кцрпично-красного порошка, плавящегося при температуре 180 - 185 С, имеющего максимум адсорбцци в видимом спектре при следующих длциах волн (фракция В): Путем хроматографии иа тонком слое силцкагеля получили: К 1=0,47 (беизол) ц 11=0,7 (метилеихлорид), Указанная фракция В мало растворима в обычных органических растворителях, хотя она растворима в спиртовом растворе карбоната натрия, окрашиваясь ири этом в ярко-красный цвет, и повторно осаждается подкислением.При обработке указанным ангидридом в пиридиие она дает феиолацетат (ъ КВг 12,15, 17,58), нерастворимый в спиртовом растворе карбоиата натрия.Указанная фракция была идентифицирована с 3-оксиизорениератеном путем хроматографцческого и спектрометрического сравнения и ио точке плавления в смеси. Красно-коричневую массу (1,5 г), первоначально собранную цз петролейного эфира, хроматографировали на колонке силикагеля и элюировали бензолом, содержащим 10% ацетона. Из большого нижнего слоя путем выпаривания растворителя ц последующей обработки петролейным эфиром получили 600 иг кирпично-красной аморфной массы, плавящейся при температуре 200 С (с разложением), обладающей максимальной адсорбццей в видимом спектре прц следующих длинах волн (фракция С): Путем хроматографии на тонком слое силикагеля получили: К 1=0,1 (бензол) и К 1=0,26 (метиленхлорид) .Указанная фракция С была идентифициро вана с 3,3-диоксиизорениератеиом путем хроматографического и спектрографического сравнения и по точке плавления в смеси. Предмет изобретения20 1. Способ получения цзэрениератена и его3-окси- и З,З-диоксипроизводиых, отлачающайся тем, что, с целью упрощения технологнче ского процесса, выращивают гриб Ягер 1 огпусез птес 11 оап 1 (штамм 2215,74 г. 1. из Коллек ции штаммов Фермиталия) в аэробных условиях в жидкой культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов, и отделяют мицелий гриба, содержащий изорениератен и его 3-окси- и 3,3-диок сипроизводные, путем фильтрования или центрцфугирования.2. Способ по п. 1, отлачающнйся тем, чтовыращивание гриба Я, гпес 11 о 1 ап 1 проводят при температуре 24 - 37 С при рН от 6 до 8 в тече ние 72 в 1 час.3. Способ по п, 1, отличающийся тем, чтоизорениератен и его З-окси-З,З-диоксипроизводные экстрагируют органическим ра:творителем и очищают путем хроматографии,