Способ отбора селекционных форм кукурузы с повышенной биологической ценностью

РЕТЕ ИСАНИЕ ПАТЕНТУ Комитет Российской Федераци по патентам и товарным знака(46) 15.1 2,93 Бюп Ма 4 (75) феденко В.С.; Глуш (73) феденко Владими (54) СПОСОБ ОТБОР ФОРМ КУКУРУЗЫ С ГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТ 5-46ко ВВ.р СавельевичА СЕЛЕКЦИОННЫХПОВЫШЕННОЙ БИОЛОЫО(57) Использование: биотехнология, селекция, биохимическая генетика, растениеводство. Сущность изобретения: селекционные формы кукурузы с повышенной биологической ценностью отбирают при их идентификации по превышению величины оптической плотности белкового экстракта размолотого зерна исследуемых образцов над данным показателем контроля. 5 табл.Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности кгенетическим исследованиям зерновыхкультур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора хозяйственноценных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна,Улучшение биохимического составазерна кукурузы путем селекционно-генетических приемов с использованием эндоспермовых мутаций приводит к повышениюсбалансированности белкового комплекса исодержания лимитирующих аминокислот.Вместе стем улучшение биологической ценности зерна в мутантах сопровождается снижением урожайности, твердости зерна иустойчивости к заболеваниям, что ограничивает широкое использование в практике. В связис, этим практическую значимость получили селекционные формы с модифицированным типом эндосперма на основе опейковоймутации, в которых устраняются указанные отрицательные признаки наряду с сохранениемповышенной питательной ценности, Учитываясходные фенотипические проявления модифицированных форм с обычными аналогами возникает необходимость в разработке способовотбора, основанных на использовании биохимических маркеров качества зерна,Известные способы отбора включаютвыделение белковых фракций зерна, различающихся по растворимости, количественное определение белка в полученныхпрепаратах методом Кьельдаля или с использованиемм индофенольного и биуретовогореагентов. Согласно другому способу выделяют зеиновую и незеиновую фракции белков сколичественным определением по г":взыванию с красителем. Отбор форм с улучшеннымкачеством зерна проводят по возрастанию доли полноценных белков и сникению количества спирторастворимого белка в суммарномбелковом комплексе зерна.К основным недостаткам указанныхспособов следует отнести длительностьпроцедуры экстракции белковых фракций сиспользованием не менее четырех различ"ных экстрагентов, необходимость количественного определения белка.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ,включающий выделение белкового экстракта вщелочной среде и проведение отбора по величине оптической плотности раствора после обработки аналитическим реагентом,Согласно способу навеску размолотогозерна трижды экстрагируют раствором бората натрия (рН 10), содержащего додецилсульфат натрия и 2-мерка 1 тоэтанол, втечение 60 мин, К суммарному экстракту прибавляют этанол до конечной концентрации 700 , инкубируют в течение 30 мин, центрифугируют и отделяют супернатант,представляющий собой суммарную зеиновую5 фракцию. В полученном экстракте иммунохимическим методом определяют содержаниеа в ,Р - и )Р -зеинов по величине оптической плотности при 410 нм. Отбор формкукурузы с повышенной биологической10 ценностью провоДят по возрастанию количества у-зеина или снижению содержанияа - И Р - зеинов.Основными недостатками указанногоспособа является необходимость количественной экстракции белка, проведение имму-,нохимического определения количества трехзеиновых фракций с применением дефицитных реагентов и материалов. При этом в результате длительного и сложного анализапроцесс селекционной диагностики устанавливает контрастные различия для модифицированной опаковой кукурузы и не даетвозмокность дифференцировать опаковыеформы от обычных аналогов по уровню у-зеина, что снижает достоверность отбора,Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение способа.Способ осуществляется следующим образом.Равные навески размолотого зерна исходной и исследуемой форм кукурузы экстрагируот 0,01-0,5 М раствором щелочи,Экстракт отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность полученногораствора при 350 нм на спектрофотометре,Отбор форм кукурузы с повышенной биологической ценностью проводят по возрастанию оптической плотности в 1,3-2,1 раза всравнении с обычными аналогами. Значение аналитической длины волны (350 нм)определено экспериментально и соответствует максимуму поглощения экстракта, Вкачестве форм кукурузы с повышенной биологической ценностью использованы эндоспермовые мутанты типа о 2/о 2, о 2/о 2зц 2/зо 2 с установленными биохимическими характеристиками и синтетики на основемутантного гена опейк.Отличительной особенностью способа50 является использование в качестве маркерного признака для отбора величины оптической плотности в максимуме поглощениящелочного экстракта зерна,По указанным отличительным признакамбыл проведен патентный поиск. Аналогичныхрешений не обнаружено, поэтому указанныепризнаки являются существенными,П р и м е р 1. Равные навески по 50 мг)размолотого зерна исходной (А 204 ф/+) и.Таблица 1 исследуемой (А 204 о 2/о 2) форм кукурузыпостоянно встряхивают с равными обьема-.ми (по 5 мл) растворов едкого кали различной малярной концентрации (0,05-0,5 М),при комнатной температуре в течение 5 5мин, фильтруют и измеряют оптическуюплотность белковых экстрактов при 350 нмна спектрофотометре Спекорд М - 40 в 0,5см кювете. Для оценки контрастности различий рассчитывают отношение измеренных величин исследуемой и исходной форм.Результаты определения оптических плотностей экстрактов, полученных при различных концентрациях растворов едкогокали, приведены в табл. 1 (данные статически достоверны, ошибка измерений не более 5%).Аналогично анализируют образцы размолотого зерна исследуемых и исходныхформ кукурузы с использованием растворов 20различной концентрации едкого натра(табл, 2),Подученные результаты показывают, чтооптимальной концентрацией щелочи, обеспечивающей контрастность различий 35 - 71%, 25является интервал 0,01-0,5 М. При использо-вании растворов с концентрацией ниже 0,01М различия незначительны (10%), а возрастание концентрации выше 0,5 М значительноудлиняет время фильтрации суспензии, 30П р и м е р 2. Аналогично примеру 1проводят отбор кукурузы с повышенной биологической ценностью (Я 155 о 2/о 2, А 619о 2/о 2) в сравнении с обычными аналогамис использованием 0,1 М раствора едкого 35кали (табл, 3),П р и м е р 3, Определяют значениясравнительного показателя аналогичнопримеру 1(концентрация едкого кали - 0,1М) для двойных эндоспермовых мутантов 40типа о 2/зи 2 на основе различных обычныханалогов (табл, 4). В качестве показателяконтрольного образца используют усредненное значение Оз 5 о=0,68 для исходныхлиний А 204, ЧЧ 155, Л 619 (примеры 1, 2).П р и м е р 4. Аналогично примеру 1проводят определение оптической плотности белковых экстрактов зерна гетерогенного селекционного материала (0,1 М раствор едкого кали). В данном случае были использованы семьи третьего года самоопыления (Яз), которые получены во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутантный ген опейк (табл, 5). В качестве показателя исходной формы используют усредненное Орз 5 о=0,68.Полученные результаты показывают, что предложенный сравнительный показатель дифференцирует не только контрастные эндоспермовые мутанты, но и синтетики, позволяющие создавать на основе мутантов селекционные формы с комплексом хозяйственно ценных признаков.Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведении отбора путем исключения длительных и трудоемких операций по количественной экстракции и определению белка, Способ исключает использование дефицитных биохимических препаратов и основан на применении разбавленных растворов доступных щелочных реагентов. При этом определение оптической плотности белкового экстракта в качестве маркерного признака является простым приемом, доступным для любой лаборатории,Способ позволит проводить экспресс- отбор Форм кукурузы с повышенной биологической ценностью при использовании в селекционной практике генетических приемов, направленных на улучшение качества зерна.10 2004144 Таблица 5 ла изобридентификацию селе, белков проводят 0,01щелочи, величину оптизмеряют при 350 нм иные формы идентифицнию данного покаэателисследуемых образцову контрольных исходны кционныем, что- 0,5 Мическойценныеируют ияв 1,3над егох форм. оставитель В. Дехред М.Моргентал рректор Л. Пилипенко дактор В, Трубченко Заказ 3357 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента13035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Уж агарина, 101 СПОСОБ ОТ , ФОРМ КУКУРУЗ ОЛОГИЧЕСКОЙ щий экстракцию исследуемых обр ходных форм в ние величины БОРА СЕЛЕКЦИОННЫХ Ы С ПОВЫШЕННОЙ БИЦЕННОСТЬЮ, включаю- белков размолотого зерна азцов и контрольных исщелочной среде, измерептической плотности и х ценных экстракциюраствором плотностиселекционо превыше,1 раза у значением