Способ подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на срезах ткани

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) и ) А 1 01 й 33/48 ПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ИЯ Т цию срера и обес- хлорного цесс под- СЛ в парафин 1 дальней- Я рототип и себя сле ьку проливке любогоособ-иючают в емого способа вы явления нервны езах ткани, вклю иала раствором Предлагаемый способия:Формалин 10;, 100 мл, 12 допроводной воде6-24 ч пособ-прототи Фикса4-12 ч.Промывка в в2 - бч Жидкость Лилли, 100 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР е(56) Коломийцев А.К, и др, Быстрый методимпрегнации аэотнокислым серебром элементов периферической нервной системы,пригодной для целлоидиновых и парафиновых срезов, Архив анатомии, 1981, М 8, с.93-96, .(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯНЕРВНЫХ ВОЛОКОН НА СРЕЗАХ ТКАНИ(57) Использование: в медицине, а именно вгистологии и патологической анатомии. иможет применяться для выявления нервныхволокон в парафиновы) срезах ткани. Сущность изобретения: проводят фиксацию ткаИзобретение относится к медицине и биологии, а именно - к морфологии и может применяться при проведении морфогистохимических исследований для выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткаЗа прототип предлага бран известный способ в волокон в парафиновых с чающий фиксацию мате ни, изготовление парафиновых срезов, импрегнацию среза 10 - 20 раствором нитрата серебра с последующим обесцвечиванием фона среза 0,1 ф раствором хлорного золота, обезвоживанием и заключением в бальзам. При этом фиксацию исследуемой ткани проводят 100 раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, а импрегнацию осуществляют накапыванием 10 - 28 раствора нитрата серебра на срез в количестве 0,5 - 1,0 мл с инкубацией при т - 37 С в чашках Петри в течение 60 - 120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза накапыванием раствора хлорного золота в количестве 0,5 - 1,0 мл в чашке Петри. Способ позволяет снизить токсичность метода путем исключения использования пиридина, упростить способ, сэкономить дорого- З стоящие реактивы и сократитьв)емя,импрегнации. 1 ил,содержащим формалин, импрегнзов 20 раствором нитрата серебцвечивание фона 0,10 растворомзолота,В полном виде, поскоготовки кусочка ткани к з одинаков (стандартен) для щего,способа окраски, с предлагаемый способ вкл дующие этапы:20-30 мл, 12 ч60 мл, 1525-30 мл, 2 серебра1 кислый формалинаммиакат серебра0,5 кислый формалин с глюкозой 20 мл, 1 мин 20 мл, 2 мин аммиачная водадист, вода 60 мл, 15 надсернокислыйаммонийСульфит натриядист. вода20 мл, 1 ч 20 мл,5 мин 20 мл,10 мин 20 мл, 1 мин 20 мл, 2 мин аммиачная водаДист. водаНадсернокислыйаммоний хлорное золотоги посул ьфитдист. водазаключение вбальзам 20 мл,1 ч 1 мл, 15 мин 20 мл, 1,мин 20 мл 5 мин сульфит натриядист. вода 20 мл, 10 мин 20 мл, 10 мин 20 мин 25 - 30 мл, 15 мин20 мл, 1 мин20 мл,5 мин хлорное золотогипосульфтитдист. водазаключение вбальзам 20 мин та-гистолога, целесообразно удлинить время на этих этапах так, как указано в заявке, без ущерба для результата импрегнации. В способе-прототипе указывается чистое вре мя методики, без учета по крайней меретрех перерывов между рабочими днями (36 ч). Т.о., полное время обработки кусочка ткани от забора материала до заключения в бальзам в способе-прототипе наименьшее - 10 40 ч(+36 ч), наибольшее -53 ч(+36 ч), Времяимпрегнации наименьшее - 24 ч 10 мин,Представляя сравнение двух способов по расходу реактивов и затраченному времени, автор считает необходимым дополнить следующее, По литературным данным и из практики хорошо известно, что наименьшее время фиксации - 12 ч, а минимальное время промывки - 6 ч. В предлагаемом способе также можно.фикси 1ровать 12 ч, промывать после фиксации 6 ч, но исходя из практических соображений, в частности -часового рабочего дня лаборанСпирт 50 Спирт 60 О Спирт 70 Спирт 80 Спирт 96 Абсолютный спирт 1 Хлороформпарафинпарафин 1парафинзаливка впарафин Депарафинирование 20 р-р нитрата серебра1 окислый формалинаммиакат серебра0,5 окислыйформалин 1 мл,1 - 2 ч 60 мл, 15 мин 1 мл,2 минг 60 мл, 15 мин45 50 55 наибольшее - 37 ч 10 мин, В предлагаемом способе полное время обработки наименьшее - 37 ч, наибольшее - 82 ч 5 мин. Время импрегнации наименьшее - 3 ч 55 мин, наибольшее - 4 ч 55 мин, Очевидно. Что в предлагаемом способе затраченное время меньше.Из представленного сравнения такжевидно, что в обоих случаях гистологический материал подвергался одним и тем же этапам обезвоживания, уплотнения и заливки в парафин, и, что соответственно, расход таких реактивов как спирт, хлороформ, ксилол, парафин одинаков. Но на этапах импрегнации при прочих равных условиях, такие дорогостоящие реактивы как нитрат серебра и золотохлористоводородная кислота в предлагаемом способе используются в 25 - 30 раз меньше. При стоимости золотохлористоводородной кислоты 565-00 руб/кг и нитрата серебра 148-00 руб/кг это достаточно экономично.Упрощение предлагаемого способа заключается в том, что процесс импрегнации не зависит от подготовительных этапов от фиксации до заливки в парафин и может быть применен на архивном материале, т.е.парафиновых блоках, приготовленных много раньше. Кроме того, за счет исключения токсичного вещества, не требуется специального оборудования и средств защиты, необходимых при работе с ядовитыми веществами.Неудобство способа-прототипа состоит также в том, что предлагаемая фиксация требует специального приготовления жидкости Лилли, Особенно нежелательным является использование пиридина, представляющего собой токсичное, раздражающее и фотосенсибилизирующее вещество, вызывающее воспаление кожи с сильным жжением и образованием трещин. Кроме того, проведение импрегнации в биологических стаканчиках требует частой смены реактивов после 4 - 6 стекол, что увеличивает расход таких дорогостоящих реактивов, как азотнокислое серебро и хлорное золото.Целью предлагаемого изобретения является снижение токсичности способа путем исключения использования пиридина, упрощение способа, экономия дорогостоящих реактивов, сокращение времени и " возможность импрегнировать архивный материал.Поставленная цель в способе подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на парафиновых срезах ткани, включающим фиксацию материала раствором, содержащим формалин, импрегнацию среза 200 ь раствором нитрата серебра и обесцвечивание фона 0,1раствором хлорного золота, достигается тем.что фиксацию проводят 10 раствором нейтрального формалина в течение 2 суток,5 импрегнацию - раствором нитрата серебрапроводят в закрытых чашках Петри с инкубацией в термостате при 37 С(т,н, "влажнаякамера") в течение 60 - 120 мин, обесцвечивание проводят путем создания такой же10 "влажной камеры" с использованием 1 мл0,1 раствора хлорного золота,Предлагаемый способ имеет 5 отличительных от прототипа признаков. Все отличительные признаки существенны для15 достйжения поставленной цели - ликвидация или замена какого-либо признака приведет к изменению положительногоэффекта. Это доказано экспериментально.Первый отличительный признак - про 20 ведение фиксации в 10 растворе нейтрального формалина в течение 2 сут. 8прототипе фиксацию проводят в жидкостиЛилли. Вообще применения 10 ф, нейтрального формалина для парафиновых срезов25 нервной ткани в доступной нам литературене обнаружено. Полученные нами результаты показали, что фиксация в 10 нейтральном формалине в течение 2 сут вполнедостаточна и дает хорошие результаты имп 30 регнации,Второе отличие предлагаемого способазаключается в том, что импрегнацию серебром проводят в плотно закрытых лейкопластырем чашках Петри (т.н. "влажная35 камера") в термостате при 37 С в течение60-120 мин. Инкубацию проводят в 20растворе нитрата серебра при 37 С в термостате, в чашках Петри, накапыванием реактива на срез (0,5-1,0 мл); Концентрация40 реактива выбрана как наиболее часто рекомендованная другими авторами, Время иусловия инкубации подбирались эмпирически. В процессе поиска оптимальных результатов проводилась инкубация срезов от 30 мин до 48 ч. Полученные результаты показали, что оптимальный результат инкубации 60-120 мин, В нашем случае технически удобнее было проводить инкубацию в течение 60 мин.Третье отличие способа заключается в том, что обесцвечивание проводят путем создания т.н. "влажной камеры" с использованием 1 мл раствора хлорного золота В чашках Петри, реактив накапывается в количестве 0,5-1,0 мл на срез); В прототипе этот этап проводится путем погружения предметных стекол со срезами в биологические стаканчики с реактивом (25 - 30 мл).Необходимость использования в предлагаемом способе именно такого порядка доказана экспериментально, В данном способе идет последовательно фиксация забранного материала, выявление нервных волокон путем импрегнации, закрепление результата импрегнации, получение контрастного препарата эа счет воздействия на остальные тканевые структуры и приготовление постоянного препарата. Изменение порядка окраски приводит как правило к полному отсутствию результата, реже - к значительному его ухудшению,Положительный эффект способа заключается в снижении токсичности за счет исключения использования пиридина, зкономии таких дорогостоящих реактивов как нитрат серебра и золотохлористоводородная кислота в 25 - 30 раз; упрощении способа за счет исключения применения специального стеклянного инструмента; сокращения времени импрегнации с 24 ч 10 мин до 3 ч 55 мин; возможности работы с архивным материалом.Изобретение осуществляется следующим образом. Пример дан в виде выписки из протокола эксперимента от 27 февраля 1990 года Я 6, Импрегнировался архивный материал от 12,05,80 г, Экспериментальное животное - собака, самка, вес - 15,5 кг. Забор материала (жизнен новажные органы) проводился после эфирно-кислородного наркоза, Материал фиксировался в 10 нейтральном формалине в течение 2 суток с последующей заливкой в парафин. С парафинового блока стенки и папиллярной мышцы миокарда на санном микротоме была сделана серия срезов толщиной 3 - 7 мкм. Срез наклеивался на предметное стекло, подсушивался и импрегнировался, Для этого срез депарафинировался по общепринятой методике, помещался в дистиллированную воду на 2 мин, затем помещался в чашки Петри, где на срез нэкапь 1 вался 20 раствор нитрата серебра. После этого чашки Петри заклеивались лейкопластырем и помещались в термостэт для инкубации на 60-120 мин при 37 С. Затем стекло со срезом проводилось через 3 порции 1% кислого формалина до полного отхождения мути. После чего срез помещали в чашках Петри, заклеенных лейкопластырем, в раствор аммиаката серебра, накапанный на срез, на 2 мин, Проводили через несколько порций 0,5% кислого формалина, останавливали импрегнацию в аммиачной воде. дифференцировали тканевые структуры в 2 фрастворе нэдсернокислого аммония, прекращали процесс дифференцировки в 7 орастворе сернистокислого натрия, тщательно отмы 55 щает время окраски 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 вали в дистиллированной воде. Обесцвечивали фон среза в 0,17 О растворе хлорного золота. Реактив накапывали на срез и помещали стекло в чашки Петри, заклеенные лейкопластырем. Восстанавливали серебро в 5 ф растворе гипосульфита 1 мин. Тщательно отмывали срезы в дистиллированной воде по общепринятой методике, Обезвоживали и заключали в бальзам также по общепринятой методике,На.полученном препарате при послойном описании под эпикардом видна четко просматриваемая поперечно-полосатая исчерчечность (серый фон). Хорошо видна капиллярная сеть за счет прокрашивания эритроцитов; по форме находящихся в микро- сосудах эритроцитов определяется просвет капилляров. Нервных волокон немного, короткие, слегка извилистые, располагаются параллельно капиллярам и кардиомиоцитам. В интрамуральном слое нервные волокна прослеживаются с трудом. очень короткие, сравнимы с диаметром эритроцитов, тонкие. Более длинные и более крупные нервные волокна кэк бы опоясывают группы мышечных волокон. Ближе к эндокэрду располагаются вдоль поперечного среза мышечных волокон. Интенсивно прокрашенные, извилистые. Под эндокэрдом: ноперечно-полосатая ичерчен ность менее четкая, капиллярнэя сеть прослеживается хорошо. Эритроциты округлой формы, свободно лежащие, Нервные волокна располагаются вдоль кардиомиоцитов (см. чертеж), а также в пространстве между несколько рэзволокненными миофибриллэми и в поперечном направлении по отношению к кэрдиомиоцитэмПредлагаемый способ был применендля исследования влияния ишемии на морфогистохимию нервных волокон миокарда.Исследовались 32 препарата, сделанных с архивного материала.Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый способ имеет большие преимущества и может широко использоваться в экспериментальной медицине и биологии. Может быть использован для архивногс материала, залитого в парафин.Не требует применения специальных стеклянных инструментов, что значительно облегчает работу лаборанта. Исключает работу с ядовитым реактивом, экономит дорогостоящие реактивы. Значительно сокрэФормула изобретения Способ подготовки гистологическогопрепарата для выявления нервных волоконна срезах ткани путем ее Фиксации, изготовления парафиновых срезов. импрегнации1835512 10 Ффф ММьЭь Составитель И,СкворцоваТехред М.Моргентал Корректор О.Кравцо акто аказ 2981Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина среза 20-ным раствором нитрата Серебра с последующим обесцвечиванием фона сре-. за 0,1-ным раствором хлорного золота, обезвоживанием и заключением в бальзам, . о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью 5 упрощения способа и сокращения времени исследования, фиксацию ткани проводят 10-ным раствором нейтрального формалина в течение 2 сут, а импрегнацию осуществляют нанесением 20-ного раствора нитрата серебра в виде капель на срез в количестве 0,5-1,0 мл с инкубацией при 37 С в чашках Петри в течение 60-120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза раствором хлорного золота в количестве 0,5-1,0 мл в чашке Петри,