Способ получения инактивированной гриппозной вакцины

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 2291 А 1 39/1 ГОСУДАРСТВЕНЮЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛЬСТВУ 3. Регвакцинуинактиви(57) Испомышленнрусных прдля заражиспользующую по 0ной активравном1:512. 4 т вавшимся количеством 10-дневных куриных эмбрионов заражают смесь двух вакцинных высокорепродуктивных штаммов, взятых в" дозе 3,0-3,5 19 ЭИДБо/0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512; используют вакцинные штаммы не зависимо от их происхождения - родительский вирусов, применявшихся для их получения (см. примеры 1 и 2), После 72 ч инкубации при 34 С в течение 12-24 ч отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость. Последнюю подвергают очистке от посторонних примесей, концентрированию и инактивации. В полученную вирусную суспенэию добавляют стабилизатор и фасуют в стеклянные флаконы различной емкости или ампулы.Заявленное предложение, суть ко гозаключается в получении "двойного торо"уро(21) 4910106/13(71) Ленинградский научно. исследователь- ский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера и Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа (72) Е.А.Брянцева, Ф.И.Полежаев, М.А.Бичу- рина, Н,Р.Розаева и Н.И,Чубарова(56) 1. ТУ 42,14.149-78 на вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную.2. Фармакопейная статья 42-249 ВСна вакцину гриппозную хромотографическую инактивированную жидкую для детей типа А,Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивированной гриппозной вакцины.Целью изобретения является получение двукратной экономии основного биологического сырья (куриных эмбрионов) и трудозатрат, связанных с его обработкой (в частности технологические операции по транспортировке, заражению, 72-часовой инкубации при +34 С, охлаждению, сбору вируссодержащей жидкости, очистке от посторонних примесей, концентрированию вирусной суспенэии, инактивации вируса, сохранению полуфабриката, утилизации отработанного сырья) при производстве инактивированной гриппозной вакцины.Поставленная цель достигается тем, что вдвое меньше по сравнению с ранее треболамент производства М 173-89 на гриппозную хроматографическую рованную жидкую для детей.ОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ льзование: в медицинской проости и касается производства виепаратов, Сущность изобретения: ения каждого куриного эмбриона т смесь вирусов гриппа, содержа мл обоих штаммов с инфекционностью 3,0-3,5 1 д Э ИДБо 0.2 мл и ри титре гемагглютининов не ниже абл.жая вакцинных штаммов, на одной партии куриных эмбрионов позволяет экономить не только половину ценного питательного продукта, каковыми являются куриные яйца, но и сократить на половину трудозатраты, связанные с их переработкой по всему технологическому циклу при сохранении гемагглютинирующей, иммуногенной активности и чистоты конечного продукта (вакцины).П р и м е р 1. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа А/Тайвань/1/86(Н 1 Й 1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и А/Миссисипи/85(НЗЙ 2) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Миссисипи/1/85), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3,5 19 ЭИДж, Инкубируют при 34 С в течение 72 ч. Зараженные куриные эмбрионы охлаждают при +4 С в течение 12-24 ч, вскрывают и собирают вируссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютинирующей активностью 1;512/0,2 мл.Концентрирование и очистку вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) от посторонних примесей осуществляют следующим образом: ВАЖ фильтруют на модуле ФТ (НПО АН СССР) через два слоя картонного фильтра (ТУ 13-7303001-686-84) и через 1 слой полимерного фильтра МФАМА (Владипор) с диаметром пор 0,8 мкм при давлении 1,2 атм, Контроль фильтрованной ВАЖ проводят в реакции торможения гемагглютинации (РГА) с 1-ной суспензией куриных эритроцитов. Концентрирование ВАЖ проводят на ультрафильтрационной установке УПЛна полых волокнах ВПУ ПА.Гельфильтрационную очистку концентрата ВАЖ проводят на силикатном сорбенте - макропористом стекле МПС (2000 "В" Горьковского опытного завода при ВНИИ НП), модифицированном поливинилпирролидоном в колонке 5 х 80 см. Элюцию проводят 0,02 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН,2-7,4+0,15 М Маб. После прохождения через сорбент собирают фракции по 20 мл, определяют в них гемагглютинирующую активность, содержание белка и овальбумина. Обьединенный вирусный материал инактивируют УФ-лучами в течение 3 мин в статистических условиях и проверяют полноту инактивации путем заражения куриных эмбрионов (2 пассажа).Гемагглютинирующую активность определяют в реакции гемагглютинации с 1- ными куриными эритроцитами. Содержание белка определяют по методу Лаури с предварительным осаждением белка 20-нойтрихлоруксусной кислотой. Содержаниеовальбумина определяют в реакции непря 5 мой гемагглютинации с комерческим препаратом. Определение количественногосодержания гемагглютинина в препаратеосуществляют методом радиальной иммундиффузии (РИД) по ЗсЫЫу (4),10 Безвредность препарата оценивают набелых беспородных мышах и морских свинках в соответствии с приказом МЗ СССР Ь31 от 13.01.83 г, Иммуногенную активностьпроверяют на беспородных мышах весом15 14-16 г. Животным вводят внутрибрюшиннооднократно и двукратно с интервалом в 14дн по О,З и 0,6 мл препарата. Кровь берут на10-14 сут после последней иммунизации,сыворотки проверяют в реакции торможе 20 ния немагглютинации (РТГА) с гомологичным штаммом вируса гриппа. Данные,представленные в табл, 1, свидетельствуюто достаточно высокой иммуногенности полученного препарата как в отношении штам 25 ма гриппа А/Тайвань/1/86 (Н 1 й 1), так иА/Миссисипи/1/85(НЗИ 2), как при однократном, так и при двукратном введении.Далее полученный вакцинный препарат испытывают в опыте перекрестной за 30 щиты иммунных животных по методу (5), Сэтой целью готовят иммунную группу животных; белых мышей весом 12-14 г иммуниэируют дивакциной внутрибрюшинно вобъеме О.З мл однократно и двукратно с35 интервалом в 21 день, Через 21 день послепоследней иммунизации мышей делят на 4группы, 2 из которых иммунизированы однократно и 2 иммуниэированы двукратно, изаражают интранаэально под легким эфир 40 ным наркозом свежими аллантоиснымикультурами гомологичных штаммов вирусегриппа: А/Тайвань/1/86(Н 1 М 1) и А/Миссисипи/1/85(НЗМ 2). Кроме иммунных животных используют две контрольные группы45 мышей, предварительно не иммунизированных, Вирусу используют в разведенияхот 101 до 10, применяя по 4 мыши нвкаждое разведение вируса, Через 72 ч послезаражения мышей обескровливают путем50 забора крови из веноэного синуса у медиального угла глаза, вскрывают, извлекаютлегкие, растирают в ступке с песком и готовят легочную суспензию. Суспензией легкихкаждой мыши заражают по 4 эмбриона, ин 55 кубируют 72 ч при ТфС. После охлаждения эмбрионов в течение 12-24 ч при+4 ф ихвскрывают и регистрируют репродукциювируса с помощью реакции гемагглютинации. Степень защиты оценивают по разницерепродукции вирусов контрольных и опыт 182279150 55 ных групп, используя расчет по Керберу (6). Данные эксперимента, представленные в табл, 2, свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей, иммунизированных как однократно, так и двукратно. В отношении штаммов вируса гриппа А/Тайвань/1/86(Н 11 ч 1) защита составила соответственно 3,759 ИДю и 5,25 19 ИДю, А/Миссисипи/1/85(НЗМ 2) - 3,75 19 ИДю.Такимобраэом, присовместном культивировании двух штаммов вируса гриппа: А/Тайвань/1/86(Н 1 й 1) и А/Миссисипи/1/85(НЗМ 2), получают вакцинный препарат, соответствующий требованиям ТУ 42.14,149-78. Параметры полученного препарата в сравнении с прототипом представлены в табл. 4,П р и м е р 2, Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа; А/Тайвань/1/86(Ь 11 ч 1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и Р - 1 (НЗИ 2) (донор репродуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3 19 ЭИДю. Инкубируют при Т - 34 С в течение 72 ч. Затем зараженные куриные эмбрионы охлаждают при То + 4 С в течение 12-24 ч, вскрывают, собирают вируссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютинирующей активностью 1;512. Далее проводят очистку, концентрирование, элюцию по методу, описанному а примере 1, Определение общего белка, овальбумина и весового количества гемагглютинина проводят аналогично описанному в примере 1 результаты по иммуногенной активности свидетельствуют от ее достаточности (средняя геометрическая титров антител в отношении штамма вируса гриппа А/Тайвань/1/86(Н 1 М 1) при однократной иммунизации составила 1;147, а В Отношении штамма вируса гриппа Р(Н 31 ч 2) составила 1:169, при двукратной иммунизации - 1;447 по отношению к обоим штаммам вируса гриппа), Далее проводят испытания препарата в опыте перекрестной защиты иммунных животных, Оранжировка опыта аналогична описанной в примере 1.Результаты опыта представлены в табл.3 и свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей в отношении гомологичных штаммов вируса гриппа. Так, степень защиты к вирусу гриппа А/Тайвань/1/86(Н 1 М 1) при однократной и двукратной иммунизации составила соответственно 3,0 и 5,0 19 ИДю, а к вирусу Р(НЗИ 2) - 1.75 и 2,75 19 ИДю 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Как и в примере 1, полученная дипакцина (табл, 4) отвечала требованиям технической документации, но для ее приготовления было истрачено вдвое меньше эмбрионов, чем при раздельном культивировании вирусов.П р и м е р 3. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа: А/Тайвань/1/86(Н 1 й 1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и Р(НЗМ 2) (донор репродуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 2,0 19 ЭИДю и 4,0 19 ЭИДю с гемагглютинирующим титром 1:512. Весь дальнейший процесс: инкубация, сбора вируссодержащей аллантоисной жидкости, технологии, проводили по методу, описанному в примере 1. Полученный вакцинный препарат по гемагглютинирующей активности отвечал требованиям, предьявленным к инактиоированным гриппозным вакцинам ИГВ), гемагглютинирующий титр равнялся 1:1024 в 0,2 мл. При определении весового количества немагглютинина в РИД с моно- специфическими сыворотками к штаммам вирус гриппа Л(Н 11 ч), Л(НЗг 1) выявлено наличие гомагглюин на А(11382) е количестве 30 мкмл, гемагглютинина А(Н 11 ч 1) не обнарухено, Была констатирована иммуногенная активность н мышэх к вирусу гриппа А(НЗИ 21- 1:15 г, з к вирусу А(Н 1 Й 1) находи: сь на уровне кнгибиторов.таким о 9 разсм, сри совместном культивировал; и двух штам,"лов гриппа А(Н 1 М 1) и А(НЗЙ), различающихся между собой по ИНфЕГцнОННОй аКтИВНОСТИ В 2 19 ЭИДЮ, НЕ приво;л к адекватному наклонению биомассь Обоих стаммов Вируса гриппа, т.Е. страдет репродукция Вируса, Взятого В до" зе, мел шей 3 19 ЭИДю,П р л м е р 4. Проводят совместное кульюеирсвание двух вакцинных штаммов вируса гриппа АТайвань 1/86(Н 1 М 1) (донор репродуктивности Л/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и Л/Миссисипи/185(НЗГ 12) (донор реп родуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Миссисипи/1/85), взятых в равных обьемах и дозах, соответствующих 3 19 ЭИД 5 о, и с равными исходными гемагглютинирующими титрами: А/Тайвань/186(Н 1 И 1) - 1/512, А/Миссисипи/1/85/(НЗИ 2) - 1/128, Полученный вакцинный препарат по гемагглютинирующей активности отвечает требованиям, предьявленным к ИГВ - 1:1024 В 0,2 мл.1822791 Тблица Нннуноганность диеекцмни, приготовленной ив сирьа, полуиенного прм соанестюн культнвнрованми двух панюе вируса гриппа: А (Тайвань) 1/86 (Н 161) + А(Ннссисипи)1/85(НЗН 2) скал титров антителнев вируса грнтпа рапар Н 1) А(Нисснснпи)1/65(Н нне величины) ДнаакцмнаА(Тамеань) /86(НН 1)+ А(Нмссиснпи)1/85(НЭН 2 Ьнутри.бровннноодюкра О,Ьнутрм 61 иввнннораукрат Т абг.и Рааупьтатн опитое аааитм веней, нмнунмвнроеан 4 ах днеакцммой, состолцей и атаманов вируса грнюа. Я (Тайвань) 1/86(11 Н ) гь А(Ниссисипи) 1/85(НЗН 2)Пр стьуровваранп вору паев ь аавмти а 16 НД,О 25 кретнаа 6,75 препарата При определении весового количества гемагглютинина в РИД выявлено: концентрация гемагглютинина А(Н 1 М 1) равнялась 26 мкг/мл, что соответствует требованиям, а к гемагглютинину А(НЗМ 2) - 10 мкг/мл, что не соответствует требованиям, предъявленным к вакцинным препаратам по этому параметру. Иммуногенная активность по отношению к штамму вируса гриппа А(Н 181) составила 1/80, а к А(НЗМ 2) - 1/40, что не соответствует требованйям к препарату по этому параметру (необходимо1/80). Таким образом, совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа А(Н 1 й 1) и А(НЗМ 2), различающихся по гемагглютинирующей активности, приводит к неравномерному накоплению компонентов, что отрицательно сказывается на качестве препарата.Учитывая вышеизложенное, оптимальным является совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа с инъекционной активностью 3,0-3,5 д ЭИД 5 о и при гемагглютинирующем титре не ниже 1/512. Таким образом, при совместном культивировании двух вакцинных штаммов вируса гриппа А(Н 1 Й 1) и А(НЗМ 2), взятых в равных обьемах и дозах, соответствующих 3,0-3,5 1 д 5 ЭИДю, при равном титре гемагглютининане ниже 1:512, имела место двукратная экономия куриных эмбрионов, а также значительное упрощение и сокращение сроков технологического процесса. Это заключа лось в следующем: в два раза сокращалисьобъемы сырья, необходимого для очистки и концентрации вируса, уменьшились затраты на транспортировку, хранение, утилизацию отходов и другое.15 Формула изобретенияСпособ получения инактивированнойгриппозной вакцины, включающий накопление вирусной биомассы путем инокуляции куриных эмбрионов штаммами вируса грип па, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используютдля заражения каждого куриного эмбриона смесь суспенэии двух штаммов вирусов одновременно, содержащую по 0,1 мл каждого с инфекционной активностью 3,0.3,5 1 ф 25 ЭИД 5 о/0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512.10 1822791 Табпнца 3 Результаты опыта защиты маей, мммуммзмроеаммых дмвзкцмюй, состолкай мзетаммэв амруса грмппат А(Тайвамь)1/86(Н 1 И 1) ь Р. Я (Ленинград)6/88)(НЗИ 2) Уровень репродукцмм емруса послаг заоакенмл втаммамм10 НД Препарат Кратностьведаммл нь защиты в 10 НД Тайвань) 1/86 Р" 1(НЗИ 2) А(Тайвань)86 Р(НЗИ 2)Н 1 И) (НН 1) Ямаакцмма А(Тайвань) 1/86(Н 1 ИГ) 1,75 дмократмалвукратмал,0 Габлмца Результаты комропл мскодюго аЬламтомсмого сырьл м целевого продукта в сравнемкм С прототипом мтролмруеьва пока" зателм Свротмп вмруса грмтпа Нсмздюе сырье.1680,50,0 50,0 рацмл ое 0 льмкг/мл 200,0 220,0 1; 1 а 7 СредеФ геометрмескьвтмтр амтмтелкроеммазей к ГА 1 И 1:9 А НЗИ 2:11 7, 7,6 2,8,А(Н 1 ИА (НЗН 2 Вывод целевого продуктам мкг/мл ГА),гСтепень очмсткм по белку г 60,0 95,Степемь окмсткм по еальбу уьг 99,8881,2 9,78 99,87 И 1)+ЗИ 2) ыкод целевого продул, г (дкеакцмма) 80,37,5 СоставительТехред М,Моргентал рректор О.Густ едакто аказ 2169 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г жгород, ул,Гагарина, 101 Со мцемтрбелка,Комцемтбуммма,А (Н 1 И 1) НЗИ 2) А (Н 1 И 1) А(НЗИ 2) А(Н 1 Н 1) А(НЗИ 2) 1 О,О10,03000,01600,0 1 ф 50,53,25 6,0 6,3 10,1;671 Г 6938,66,0